课件分子生物学基因工程和核酸杂交.ppt

* 质粒的分子量一般为106~108 ，小型质粒的长度一般为1.5~15Kb。 遗传标志，如：抗生素的抗性基因，?-半乳糖苷酶基因（lac Z）等。 * cDNA探针的制备由于受RNA酶的影响有一定的难度，曾经限制了其应用。随着反转录试剂盒的商品化，cDNA探针的制备 * * * 1．生物素标记核酸探针 生物素是目前应用最广的非同位素标记物之一，生物素是一种小分子水溶性维生素。最早发现它可通过一条碳链臂可共价连接在嘧啶环的5位碳原子上，对TTP 或UTP进行标记。目前一系列生物素标记dATP和dCTP 也被应用，例如Bio-16-UTP、Bio-7-dATP、Bio-11-dCTP和Bio-11-UTP等，其中中间数字表示多胺连接臂的碳链长度。上述各种标记核苷酸均可替代同位素标记的相应dNTP，在DNA聚合酶催化下，通过缺口平移法或随机引物等方法将它们掺入到DNA分子中，从而获得带有生物素的DNA或RNA探针。同时生物素还是一种抗生物素蛋白（卵白素）和链霉素类抗生物素蛋白的配体，可以利用免疫法进行检测。 2．光敏生物素标记核酸探针 生物素酶促标记法由于操作复杂，价格昂贵，限制其使用，因此人们设计出化学标记法，直接将生物素标记在核酸探针上，即光敏生物素标记核酸探针。 光敏生物素是由对光敏感基团和生物素结合而成的一类标记物多种光敏基团可以和生物素结合，但它们具有共同的结构特点，即有一碳原子数目不等的连接臂，一端连接光敏基因，另一端连接是生物素。光敏基团的作用是在光照下与碱基发生共价交联反应，而生物素则为检测时的标记物。各光敏基团对光敏感性和对碱基种类的亲和力有所不同。如光生物素的光敏基团芳香叠氮基团，在可见光照射下转变为活性芳香氮烯基，随后与DNA和RNA的碱基发生交联反应。补骨脂素生物素的光敏基团补骨脂素，在320～400nm光照下，其分子中4’，5’的双键能与DNA分子的胸腺嘧啶的4,5位的双键发生加成反应。 光敏生物素标记核酸的方法简便易行，不需要价格昂贵的酶，只需光照，探针稳定，灵敏度可达pg水平，适合于DNA、 RNA的标记，并且这类标记物大多已商品化 2．非放射性的探针的检测 非放射性探针的标记物不同，其检测体系和方法也不同。除酶直接标记的探针外，其他非放射性标记探针的显示常需进行二步法。 （1）偶联反应　　探针与检测体系发生偶联反应， 生成能与显色系统作用的中间物质，大多数非放射标记物是半抗原， 通过抗原-抗体免疫体系与显色体系偶联。根据偶联反应的不同，可分为直接法、间接法、直接亲合法、间接亲合法及间接免疫－亲合法。（图6-11） 图6-11 非放射性探针检测示意图 （2）显色反应　　 1）酶促显色法　　常用的免疫酶学检测方法有两类： ①碱性磷酸酶(ALP)显色体系 ：以BCIP/NBT（5-溴-4-3吲哚磷酸/硝基四氮唑蓝）为底物，结果为蓝紫色沉淀。 ②辣根过氧化物酶(HRP)显色体系：以DAB（四氢氯化二氨基联苯胺）/H2O2为底物，结果为棕色；或以4-氯-1-萘酚/H2O2为底物，结果为蓝色。 两种显色系统相比较， ALP的灵敏度和分辨率较HRP显色体系高约10倍左右，但HRP的优点为价廉、稳定。 2）荧光法　　荧光探针主要用于原位杂交，常用的荧光素有异硫氰荧光素、羧基荧光素、四甲－６羧罗丹明等。不同的荧光素在激光照射下发出不同颜色荧光。采用荧光显微镜或荧光检测系统检测荧光信号。 3）化学发光法　　化学发光指在化学反应过程中伴随有发光反应，从而实现检测。　　 总之， * * 毛细管虹吸原理 转移缓冲液通过滤纸的毛细管上升，形成由下至上的液体流，凝胶上的单链DNA被洗脱并转移到薄膜上，因薄膜的吸附作用而使DNA转移固定在膜上，转移的速度取决于DNA片断的大小和凝胶中DNA片断的浓度 * * 用Primer Premier 5.0软件设计IL-6引物及探针。上游引物和下游引物分别位于IL-6 基因的第二、三外显子；捕获探针5’端用氨基修饰，可以与DNA结合微孔板表面的NOS基团共价结合，“竖直”地包被于微孔板内；检测探针5’端、3’端均用生物素修饰，可与亲和素标记的辣根过氧化物酶(Avidin－HRP)结合。 扩增产物热变性后与检测探针一起加入已包被捕获探针的微孔板内进行夹心杂交，最后加入亲和素-辣根过氧化物酶及其底物，显色检测杂交信号。 * * 斑点杂交是将待检样品（DNA、RNA 或细胞）直接点到膜上，烘烤固定。 3、斑点杂交（Dot-blot） * 斑点杂交不需电泳和转膜过程，整个操作过程简便、快速。 但结果无法判断核酸片段的大小，也无法判断样品溶液中是否存在着不同的靶序列。 多用作核酸定性或半定量分析，而且便于杂交条件的摸索。 * 菌落杂交示