重组人亲环素A的表格达纯化-1104班吴敌.docVIP

Cyclophilin A的表达及纯化 报告题目 Cyclophilin A的表达及纯化 作者姓名 吴敌 班级学号 1104班2011114020409 指导教师 张新潮 完成时间 2014年11月 生物学实验教学中心  重组人亲环素A(rhCyPA)的表达纯化 吴敌（指导老师：张新潮） （湖北师范学院生命科学学院生物技术1104班 湖北 黄石 435002） 摘 要：将亲环素A基因片段插人原核表达载体pET 中, 得到重组质粒p ET-CyPA , 转入大肠杆菌获得高效表达。重组有CyPA基因的大肠杆菌M15在含有氨苄青霉素（100ug/ml）和卡那霉素（25ug/ml）的LB培养基中培养，当A600达到大约0.5时，终浓度为1mM的异丙基硫代–B-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养6h，再经过收集菌体、离心、重悬、超声波破壁、离心后得到蛋白粗提液。蛋白粗提液经SephacryTM S-100分子筛层析和DEAE-Sepharose CL-6B柱层析得到纯化的重组人CyPA。 关键词：重组人亲环素A ; 基因表达; 层析; 引言 CyP18是最早发现的亲环素类蛋白，分子量为18000，也称CyPA，存在于细胞质、核膜及高尔基体中，具有亲环素家族的典型特征，是Cyps家族中最丰富的一种，约占细胞总蛋白的0.1%一0.4%[1]。人的CyP18由165个氨基酸组成，由X-衍射可知[2]，CyP18的主要二级结构以β-折叠为主，并伴有α-螺旋、β-转角及无规线团，8条反平行的β-折叠片段分别与环(Loop)和包埋于件折叠片段两端的3条α-螺旋相连接，形成一个右手R-桶型结构，内部形成疏水中心。 亲环素A (Cyclophilin A CyPA)具有肤基脯氨酸顺/ 反异构酶(PPIase) 活性和结合免疫抑制剂环抱素A 的能力[3,4]。后来发现CyP是一个在进化上相当保守、功能相关的蛋白质家族, cyPA 是这个家族中最主要的成员。近年发现全身性红斑狼疮等自身免疫病人体内存在抗CyPA自身抗体, 检测CyP 抗体有助于了解自身免疫病的发病机制和进行临床诊断[5] . 这些工作都需要大量纯化的人CyPA。用大肠杆菌体外表达人CyPA, 能满足这些工作需要, 避免了从人组织提取纯化的麻烦。此外, 利用基因克隆表达技术还能进行定点突变, 作为其结构、动力学和作用机制研究的辅助手段。 本研究在对CyPA 基因进行了克隆和序列测定的基础上, 构建了表达载体, 在大肠杆菌中获得高水平表达[6]。 1.实验材料与试剂 1.1实验材料 c115a菌种（大肠杆菌） 1.2抗生素储备液 氯苄青霉素储备液：用无菌二次重蒸水配成100mg/mL氨苄青霉素（ampicillin，简称Amp）溶液，分装，-20(C保存备用。使用时每毫升培养基加入0.7～1(L，终浓度为70～100(g/mL。 卡纳霉素储备液：用无菌二次重蒸水配成10mg/mL卡那霉素（kanamycin，简称Kan）溶液，分装，-20(C保存备用。使用时每毫升培养基加入3～5(L，终浓度为30～50(g/mL。 1.3IPTG储备液 将2g异丙基硫代--D-半乳糖苷（isoprophyl thio--D-galactoside，简称IPTG），溶于二次重蒸水中，过滤除菌，分装，-20C保存备用 1.4缓冲液 不同浓度的Tris-Hcl缓冲溶液 1.5 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 试剂 用量 12%Gel 5ml 双蒸水 1.6ml 30%丙烯酰胺 2.0ml 1.5M Tris-Hcl（pH=8.8） 1.3ml 10%SDS 0.05 10%过硫酸铵 0.05 TEMED 0.002 浓缩胶（5%Acrylamide） 1 双蒸水 1.4 30%Acrylamide 0.33 1.0M Tris-Hcl 0.25 10%过硫酸铵 0.02 10%SDS 0.02 TEMED 0.0 2 实验方法 2.1活化菌种 取洁净的试管一支，加入6ml LB液体，并用10ul的枪头注入3ul kana以及6ul Amp这两种抗生素溶液后，再加入120ul c115a菌种，在37c下150r/min培养过夜 2.2接种扩大培养 100mlLB液体+100ulAmp+50ul Kana+6ml菌液，在37c下180r/min培养3小时至OD值为0.5左右后加入100ul IPTG诱导物诱导，继续在37c下180r/min条件下诱导5-6小时后。 2.3蛋白质提取 将菌体培养液转移到250ml的大离心瓶中，在5