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鼠疫菌MLVA分型技术及其应用 张蓉1 综述 王鹏2 宋志忠2 审校 （1. 大理学院公共卫生学院；2. 云南省地方病防治所 云南省鼠疫防控技术重点实验室）基金项目：卫生部行业基金（201202021）；国家自然科学基金；云南省应用基础研究（2011FB134） 责任作者：宋志忠，作者简介：张蓉 [关键词]：鼠疫菌 分子分型 VNTR MLVA 鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)是鼠疫的病原菌，历史上曾引发三次世界范围的鼠疫大流行，给人类带来巨大的灾难。近年来，鼠疫动物间疫情仍呈活跃态势，WHO己将其列为“近20年来重新流行的急性传染病之一，因此鼠疫的防治仍是不容忽视的问题。鼠疫菌只有一个血清型，但不同的鼠疫分离株毒力差异较大，对人群危害性也不同。依生化特性不同，鼠疫菌可分为4个型，即古老型（Antiqua），中世纪型（Medievalis），东方型（Orientalis)及田鼠型（Microtus）。依生化特性结合分离生境的差异，中国的鼠疫菌分为18个生态型疫源地[1]。随着分子生物学的发展，从基因的角度对鼠疫菌进行分型已成为可能，因此对鼠疫菌进行基因组多态性研究，以此建立多态性数据库，为鼠疫菌的快速鉴定溯源及制定合理的防控措施提供更多依据。 近年来，有很多分子生物学方法被用于鼠疫菌的分型研究，如：多位点序列分析(Multilocus sequence typing, MLST )、限制性长度多态性(Restriction fragment length polymorphism, RFLP )、随机扩增多态性DNA ( Random amplified polymorphic DNA, RAPD )、脉冲场凝胶电泳(Pulsed-field gelelectrophoresis, PFGE )、插入序列100 ( IS 100 ) 、核糖体分型(Ribotyping )和多位点可变数目串联重复序列分析(Multiple-locus variable-number tandem repeat analysis, MLVA）[2-6]等。在实际应用中序列多态性的检测手段 繁琐对仪器、设备要求高 所以较少采用。而MLVA只是检测长度多态性，需简单的 P C R扩增和电泳技术即可完成， 所以越来越多的得到人们的应用，被公认为第二代病原菌分型技术，受到鼠疫研究者的广泛关注，本文就MLVA技术在鼠疫菌的分型中的应用作一综述。 MLVA的分型原理 在真核和原核生物基因组中，广泛存在着一些以一段相同或相似的核苷酸序列为重复单位(也称为核心序列)，首尾相连重复的序列。它们在不同的个体之间由于重复数的不同，而造成生物的多态性称可变数目串联重复序列(Variable-number tandem repeat,VNTR)， 多位点可变数目串联重复序列分析 (Multipl locuse VNTR ,MLVA)，将多位点组合进行个体鉴别的方法，该方法通过区分基因组上多个具有多态性串联重复序列位点的重复数来区分菌株。串联重复序列的形成机制，目前有两种观点：一种是 DNA在复制滑移过程中由于核苷酸错配或重组所形成的[]；另一种观点认为环境诱导选择，环境压力（包括宿主的改变使基因组 DNA组成发生了非连续的变异[]。 MLVA分型稳定并已被广泛应用，如炭疽杆菌 、布鲁氏菌、鼠伤寒和伤寒沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌 O157 ∶H7 、钩端螺旋体、结核分枝杆菌[-14]。鼠疫菌基因组序列分析显示，在鼠疫菌基因组中存在着较大量的串联重复序列，而同一位点的串联重复序列在不同的鼠疫菌株间存在着多样性。因此，MLVA可以作为鼠疫菌稳定的分子分型方法用于遗传背景研究。 二、鼠疫MLVA技术国际进展 2000年，Adair等人最先在鼠疫耶尔森氏菌中确定了四核苷酸的串联重复序列（CAAA)n在35株鼠疫耶尔森氏菌中证实该区域存在9个等位基因，多态性指数达0.82，在实验室条件下重复培养细菌，其VNTR的等位基因类型没有改变，提示这段序列可以用于鼠疫菌基因组多态性分析[15]。2001年法国团队Le Flèche 等应用G. Benson等人开发的TRF(Tandem Repeats Finder)软件[16]建立了一个病原菌VNTR数据库（http://minisatellites.u-psud.fr)，并以两个人类重要病原菌（鼠疫菌和炭疽杆菌）重复序列的特点为例介绍该数据库的使用方法。他们对2001年公布的鼠疫菌东方型菌株CO92的全基因组进行重复序列的搜索，按照重复单位的长度在9bp以上且重复次数至少7次的标准，鼠疫菌含有64个重复序列。他们从中选择了25个位点，将180株鼠疫菌分成61个基因组型而