中国野生毛葡萄病原菌诱导响应VqCOI1基因克隆及表达分析.docVIP

中国野生毛葡萄病原菌诱导响应VqCOI1基因克隆及表达分析 　　摘要: 【目的】为了验证COI1基因在葡萄抗病防御机制中的作用，【方法】在前期通过抑制消减杂交技术（SSH）获得中国野生葡萄毛葡萄株系‘商-24’ COI1基因EST序列的基础上，采用RT-PCR从毛葡萄‘商-24’中分离到COI1基因cDNA序列， 并通过实时定量PCR和半定量PCR分析了COI1基因的表达特异性，以期验证其在葡萄抗病防御机制中的作用。【结果】序列分析表明，VqCOI1基因长2 455 bp，编码598个氨基酸残基，相对分子量为67.87 ku，等电点为5.85。同源性分析表明，它与已克隆的大豆（Glycine max）COI1基因（GenBank登录号: AAZ66745.1）相似性最高为79%。实时定量PCR技术用来检测VqCOI1基因在受到病原菌侵染和激素处理时在抗病品种‘商－24’中的表达情况，结果表明，在白粉菌诱导初期，抗病的毛葡萄株系‘商-24’ VqCOI1基因表达量升高，这可能是因为它参与了病原菌诱导的JA信号调节途径。水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、乙烯（Eth）处理表明VqCOI1基因表达受激素分子调节，这些信号分子可能交叉调节这一基因的表达。在嫩叶、嫩茎、花、果皮、卷须等不同葡萄组织中的表达表明VqCOI1基因的表达具有空间差异性。【结论】这些结果暗示着VqCOI1的表达响应病原菌侵染并受生物胁迫相关激素的调控，很有可能在葡萄防御病原菌侵染的机制中发挥重要作用。 　　关键词: 中国野生葡萄； VqCOI1基因； 克隆； 表达分析 　　中图分类号：Ｓ６６3．1 文献标志码：Ａ 文章编号：１００９－９９８０?穴２０12?雪０6－990－０7 　　植物在自然条件下，长期的生长发育过程中常常受到周围环境中各种因子的刺激，例如干旱、水淹、高盐、低温、病毒、细菌和真菌等， 当植物受到病原菌侵染时，随着植物与病原菌的长期互作，协同作用，已经进化出了许多防御抗性机制来抵抗病原微生物的侵袭。这种防御机制包括植物自身的一些生理作用或化学障碍物以及病原物侵染植物后诱导植物一系列防卫反应的发生。许多植物的代谢过程都是受到多种酶的合成与降解的平衡作用调控的，其中，植物通过泛素化途径对许多蛋白的降解过程在植物的抗病反应中起着重要作用。许多研究表明，E3泛素连接酶和相关蛋白的降解在植物信号转导途径中起着重要作用，并最终导致植物抗病性的发生[1-2]。 　　病虫害的侵染会刺激植物体内的合成JA和Eth，启动植物内源信号分子的调节，进而激活一些病程相关蛋白的表达，各种途径相互交叉，使得植物形成对病原菌的应激反应。研究表明，JA信号途径在植物抗性调节中起着重要作用[3]。COI1基因是是目前所发现的拟南芥茉莉酸信号传导途径中最重要的调控基因。它与植物的育性和抗性两类完全不同的性状有关。COI1蛋白包含有一个F-BOX结构域和不完整的富含亮氨酸重复结构域（LRR），它是一个新的F-BOX蛋白[4]。它可以与ASK1/ASK2、CUL1和RBX1结合，形成SCFCOI1 E3连接酶复合体[5]，这个SCFCOI1 E3复合物可以特异识别茉莉素信号转导途径的一些调控因子，使其泛素化而由26s蛋白体降解，从而开启下游基因的表达和下游茉莉素信号传导，调控植物的生长发育和抗逆性。在拟南芥coil1突变体发现后的十年中，一直没有找到 SCFCOI1的靶蛋白。直到 2007年，3个课题组分别利用不同的方法同时发现了拟南芥中茉莉酸信号途径的重要调控因子-JAZ蛋白[6]。Thines 等[6]利用了JAZ1-GUS融合蛋白证明了JAZ蛋白为SCFCOI1的底物。Yan等[7]采用生物芯片技术进一步证明了这种蛋白质是茉莉酸响应基因的负调控因子。由于它特有的jas保守结构域，它可以通过COI1介导的植物泛素化途径调节植物早期抗性反应和诱导植物抗病性。目前，COI1在葡萄等单子叶植物中的分子机制尚不清楚。由于葡萄白粉病[Uncinula necator （Schw.） Burr]在世界范围内的严重危害性，为了深入了解葡萄抗白粉病分子机理，项目组在前期构建了接种与未接种白粉菌的高抗白粉病的中国野生葡萄毛葡萄株系‘商-24’ SSH文库，获得了COI1基因的EST序列（GenBank number: JK266496）。我们就是在此基础上，采用RT-PCR技术克隆了中国野生葡萄COI1基因，并进行表达分析，为进一步深入了解COI1 基因的生物学功能奠定基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 葡萄材料与处理 　　采集毛葡萄‘商-24’嫩叶、嫩茎、花、果皮、卷须不同组织，迅速置于液氮罐带回实验室-80 ℃冻存。 　　1.2 总RNA提取与cDNA第1链合成 　　葡萄叶片总RNA的