研究生生化实验技术SOD-提取研究.docVIP

大豆SOD提取纯化分离及纯度、比活力测定 生物化学与分子生物学专业硕士研究生生化技术实验 指导教师：杨致芬，杨致荣，范月仙，潘登奎 一、[目的要求] （1）掌握分段盐析沉淀分离蛋白质一般方法和技术要领； （2）掌握凝胶过滤前期准备与技术方法、基本原理和有关操作技术要领； （3）掌握SOD一般活性测定、PAGE法对酶活性鉴定技术方法； （4）掌握考马斯亮兰G250测定蛋白质方法； （5）掌握冷冻离心技术方法要领。 二、[实验材料及处理] 秤取20g大豆（晋豆5号）经表面消毒后，在蒸馏水中浸泡5～6小时（或晚上10点处理过夜）备用。 三、[试剂与仪器](1d) 1.SephadexG-100，20-25g（2.5cm×50cm层析柱/根干胶用量） 2.0.05mol·L-1pH7.8磷酸缓冲液（提取液）；配置250ml，方法参见蒋立科主编《现代生物化学实验技术》p.307。 3.1mmol·L-1 pH7.0磷酸缓冲液（洗脱液）；配置2000～3000ml，方法同上第2。 4．酶活性测定反应液：参考高继国，郭春绒主编《现代生物化学实验》P.108～112。 ①0.05mmol·L-1磷酸缓冲液（pH7.8）； ②秤取0.9700g甲硫氨酸用0.05mmol·L-1磷酸缓冲液（pH7.8）溶解定溶至50ml即为130(mol·L-1 。 ③0.05mmol·L-1磷酸缓冲液（pH7.8）配置750(mol·L-1NBT（氮兰四唑）：秤取32mgNBT用0.05mmol·L-1磷酸缓冲液（pH7.8）溶解定溶至50ml，装棕色瓶低温（0～4℃）保存。 ④20(mol·L-1核黄素：秤取0.00753g核黄素用水定溶至1000ml。 ⑤100(mol·L-1的EDTANa2溶液：秤取0.037g用溶0.05mmol·L-1磷酸缓冲液（pH7.8）解定溶至100ml，从中取出10ml再用0.05mmol·L-1磷酸缓冲液（pH7.8）定溶至100ml。 5．氯仿：乙醇（2﹕3v/v）混合液； 6．(NH4)2SO4固体粉末（用研钵充分研磨秤粉末，颗粒越细越好）； 7．K2HPO4（研钵充分研磨成粉末，颗粒越细越好）； 8．所需要仪器设备消耗材料 自动部分收集器1台； 层析柱2.8×60cm 1根； 250ml三角瓶2个；500ml烧杯3个； 10cm长度滴管2个； 电子天平1台； 抽滤装置； 高速冷冻离心机1台（国产，湘仪产）； 蠕动泵2个； 核酸蛋白检测仪2台； 纪录仪2台； 配电盘2个； 真空泵1个； 真空干燥器1个； 100度恒温水浴器1个； 直径2cm乳胶管1米； 1K滤纸5张。 *注意事项：①所有试剂及储备液均使用DW配置；②所有容器、量具、玻棒等度必须用去污粉洗涤，双重蒸水冲洗一次以上；③配置(mol级浓度溶液时，一定要用1/10000杆量电子天平秤量，决不可以台秤代之；而%浓度或mol级浓度配置时可用台秤秤量；④ 配置试剂中，需要低温保存的一定要低温保存；该用棕色瓶装的也决不使用白色瓶装；该临时配置的溶液，做试验过程中出时间安排好进行配置，决不可因为配置试剂而窝工。 四、[实验操作](1d) 1.凝胶处理： 根据葡聚糖凝胶材料瓶外包装上的技术参数和层析柱容积计算凝胶用量→秤取凝胶→放入500ml锥形三角瓶中→加入约350ml重蒸水→沸水浴5小时→冷至室温→准备装柱。 *注意事项：参考《现代生物化学实验技术》P.117～118。 2．装柱 将处理好的凝胶悬浮液轻轻晃动→倾出上层细小颗粒上层液（依据实际情况反复3-5次）→真空排气30min→一次性连续倾入层析柱中→让其自然沉降，装胶高约50cm左右高（注意千万不要加入气泡，且不能分层或出现不均匀现象）→用0.05mol·L-1pH7.0磷酸缓冲液平衡（约300ml）→加入床面保护滤纸(亦可在胶面上加1cm处理好的凝胶SephadexG-25)→上样。 *注意事项：参考蒋立科，杨婉身主编《现代生物化学实验技术》P.111～112。 3.上样（上样要求祥见后面操作用）：上样后用1mmol·L-1磷酸缓冲液洗脱30min（洗脱速度为～1ml/min）→A280nm开始检测、记录、分部收集→用SOD活性测定方法检测洗脱峰对应管中SOD活性（→在洗脱曲线中描出活性曲线）。 *注意事项：参考蒋立科，杨婉身主编《现代生物化学实验技术》P.113～114。 4.测定上样样品SOD活性和蛋白质含量，同时测定具有SOD活性管中蛋白质含量，求出比活力及比活力提高倍数。 *注意事项：测定方法详见参考文献或注释。 5.根据SDS结果中谱带数目鉴定SOD纯度（专业生物化学研究生完成，非生化专业研究生舍去此项实验）。 五、[粗酶液制备、分段盐析、层析脱盐和分离] 1．秤取10g浸泡处理好的大豆→加入20～3