片段的分离和回收质粒DNA的连接和转化课件.ppt

提高连接效率的方法： 将连接液放置4℃过夜可以增加连接效果。 连接反应结果检测： 转化宿主菌，阳性克隆筛选。 DNA凝胶电泳。 实验材料： 纯化后的酶切质粒载体 目的基因片段 DNA Ligation Mix（Takara） T4 DNA 连接酶 缓冲液系统 方法和步骤 反应体系： 线性化载体 pCDNA3 （EcoR I 和Xba I 酶切） 3 μl（~0.1 μg） 3倍分子的目的基因p38片段 （EcoR I 和Xba I 酶切） 5 μl DNA Ligation Mix 8 μ 总体积 16 μl 盖上管盖，混匀，台式离心机上离心５秒。 24℃连接1-3小时。 反应结束后于-20℃保存。 二、重组DNA的转化及转化子的筛选 实验原理: 转化(Transformation)：细菌细胞的生物学特性由于吸收外源DNA发生可遗传的改变。 重组DNA转化：DNA重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。 感受态(Competence)：通过人工诱导的方法，使自然状态下无法发生转化的细菌，如大肠杆菌，处在易于接受外源DNA分子的状态即感受态，从而使转化得以高效率地进行。 转化子(Transformant)：即转化后的受体菌,又叫重组子。重组子在培养环境中形成的克隆称为阳性克隆，外源DNA可在阳性克隆中大量扩增、繁殖、保存以及表达目的基因产物。 质粒DNA转化大肠杆菌： DNA分子转化步骤： 吸附：双链DNA分子吸附于受体菌表面； 转入：双链DNA分子解链，一条链进入受体菌，另一条降解； 自稳：外源质粒DNA分子的细胞内复制成双链； 表达：供体基因随同复制子同时复制、分裂、转录翻译。 转化效率：105~107转化子/μg DNA。获得高转化效率的关键是感受态细菌的制备。 感受态细胞能接受外来DNA 分子的机制 局部原生质体化假说——细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。证据有： 发芽的芽孢杆菌容易转化； 大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化； 适量的溶菌酶能提高转化率。 酶受体假说——感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。证据是： 蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用； 细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现； 分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。 转化子的筛选方法： 插入失活法 抗性筛选 蓝白筛选(α互补法) 杂交筛选 免疫学筛选 酶切图谱鉴定 菌落PCR鉴定 常用方法： 抗性筛选法： 菌株为某种抗性缺陷型，而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素、卡拉霉素等），这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。 α互补法： 许多载体（如pUC系列 ）含有一个大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(lac z基因)的短区段，其中含有lac z的调控序列和头146个氨基酸编码区，这个编码区中插入一个多克隆位点。而受体菌则含编码β-半乳糖苷酶C端氨基酸的序列。当没有外源基因插入时，二者融为一体后，有β-半乳糖苷酶表达，它能水解培养基中生色底物—5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal ）形成蓝色菌落。而当有外源基因插入到多克隆位点，造成插入失活，从而使lac z基因不表达而形成白色菌斑。通过颜色不同可以区分重组子和非重组子。 X-gal + IPTG + AMP with lacZ = blue colony 实验材料 LB培养基 质粒pCDNA3-p38连接产物（含Amp抗生基因） CaCl2 0.1M Amp DH5α 大肠杆菌 感受态细胞制备 1. 将宿主菌DH5 大肠杆菌在琼脂培养基平板上划线，37℃培养16～20h。 2. 挑取单菌落转入20ml LB培养基锥瓶中，37℃震荡过夜。 3. 从中取2ml菌液转入50ml LB培养基中37℃震荡培养4～5h，测A600达0.4～0.5。 4. 培养物冰上放置10min。 5. 转入一50ml离心管，于4000rpm下4℃离心10min。 6. 弃上清，倒置离心管1min，流尽剩余残液然后加入10ml用冰预冷的0.1m