《食品安全地方标准 食源性致病微生物快速检测》（征求意见稿）.docVIP

DBS 江苏省地方标准 DBS 32/ XXXXX—XXXX 食品安全地方标准 食源性致病微生物快速检测 公开征求意见稿 XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 江苏省卫生和计划生育委员会发布 前言 本标准系首次发布。 食品安全地方标准食源性致病微生物快速检测????? 范围 本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157：H7、副溶血性弧菌志贺氏菌的实时荧光PCR检测方法。 设备和材料实时荧光PCR仪。 冷冻离心机12000 r/min，4 均质器。 恒温空气振荡摇床：36±1℃、30 ±1℃、42℃±1℃。 恒温水浴锅：95±1℃。 天平：感量0.1 g。 冰箱：4-20℃。 微量移液器：0.1μL -2.5μLμL-10 μL、10 μL-100 μL、100 μL-1000 μL。 灭菌吸头：10 μL、200 μL、1000 μL。 。 灭菌1.5 mL离心管。试剂与培养基 应符合GB/T 6682中一级水的规格，121高压灭菌30 min。 Taq DNA聚合酶：5 U/μL。 dNTP）：10 μmol/L。 DNA提取试剂：称取0.1 g Chelex 100粉末，加水定容至100 mL，保存于-20备用；或使用商品化的DNA提取试剂盒。 10×PCR缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），200 mmol/L 氯化钾，15 mmol/L 氯化镁。 引物和探针：引物和探针序列见附录A，加水稀释至10 mmol/L，其中探针的5’端标记FAM，3’端标记TAMRA。 7.5 %氯化钠肉汤：见GB 4789.10。 缓冲蛋白胨水（BPW）： 见GB 4789.4。 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：见GB 4789.4。：见GB 4789.4。 李氏增菌肉汤LB（LB1，LB2）：见GB 4789.30。 改良EC肉汤：见GB 4789.36。 3％氯化钠碱性蛋白胨水：见GB 4789.7。 志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素：见GB 4789.5。 操作步骤样品制备和增菌培养 金黄色葡萄球菌的样品处理与增菌液选择照GB 4789.107.5 %氯化钠肉汤增菌液放置于恒温空气振荡摇床中，36℃±1℃、200 r/min振摇h。 沙门氏菌的样品处理与增菌液选择照GB 4789.4，BPW增菌液放置于恒温空气振荡摇床中，36℃±1℃、200 r/min振摇h；移取0.1 mL，转接种于10mL SC增菌液，36℃±1 ℃和42℃±1℃恒温空气振荡摇床，200 r/min振摇4 h。 单核细胞增生李斯特氏菌的样品处理与增菌液选择照GB 4789.30，LB1增菌液放置于恒温空气振荡摇床中，30℃±1℃、200 r/min振摇h；移取0.1 mL，转种于10 mL LB2 增菌液内，30 ℃±1℃，200 r/min振摇4 h。 大肠埃希氏菌O157：H7的样品处理与增菌液选择照GB/T 4789.36改良EC肉汤增菌液放置于恒温空气振荡摇床中，36℃±1℃、200 r/min振摇h。 副溶血性弧菌的样品处理与增菌液选择照GB 4789.73％氯化钠碱性蛋白胨水增菌液放置于恒温空气振荡摇床中，36℃±1℃、200 r/min振摇8h。 志贺氏菌的样品处理与增菌液选择照GB 4789.5志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素增菌液放置于中，41.5℃±1℃厌氧h。DNA提取取.1中培养的增菌液1 mL，加入1.5 mL无菌离心管中，8000 r/min离心5 min，吸弃上清；加入50 μL DNA提取试剂（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），混匀后水浴5 min，12000 r/min，4离心5 min，取上清保存于- 20备用。也可使用商品化的细菌DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书操作提取致病菌DNA。实时PCR检测 配置PCR反应体系（25 μL）：10×PCR缓冲液2.5 μL，引物各0.5 μL，探针1 μL，dNTP 1 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，水17 μL，模板DNA 2 μL。 反应条件：95预变性30 s；94变性5 s，60oC退火延伸40 s，进行40个循环。PCR反应参数可根据PCR仪型号的不同进行适当的调整。 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照为阳性菌株DNA，阴性对照为用水代替样品进行增菌得到的DNA提取液，空白对照为。 实验结果与判定阳性对照应出现典型扩增曲线，Ct值30；同时，阴性对照和空白对照应无扩增曲线，Ct值40。否则，实验视为无效，需重新实验。实验结果Ct值40，可判定样品结果为阴性，直接报告目标致病菌未检出Ct值35，样品结果为阳性