葛根素对IL—1β损伤大鼠关节软骨细胞增殖影响.docVIP

葛根素对IL—1β损伤大鼠关节软骨细胞增殖影响 　　[摘要] 目的 观察葛根素（Pue）对IL-1β损伤大鼠关节软骨细胞增殖的影响。 方法 取10日龄大鼠膝关节软骨做体外细胞培养，培养后软骨细胞随机分为六组：正常组、IL-1β组、地塞米松组、Pue50组、Pue100组、Pue200组。其中，IL-1β组、地塞米松组、Pue50组、Pue100组、Pue200组分别加入IL-1β（5 μg/L）10 μmol、IL-1β（5μg/L）10 μmol+地塞米松10-9 mol/L、IL-1β（5μg/L）10 μmol+Pue 50 μmol/L、IL-1β（5 μg/L）10 μmol+Pue 100 μmol/L、IL-1β（5 μg/L）10 μmol+Pue 200 μmol/L，使用酶标仪测定570 nm光吸收值，计算各组软骨细胞的增殖率。 结果 正常组、IL-1β组、地塞米松组、Pue50组、Pue100组、Pue200组软骨细胞的增殖率分别为0、-11.044%、0.471%、-2.424%、2.828%、5.387%，地塞米松组、Pue50组、Pue100组、Pue200与IL-1β组比较，差异有统计学意义（P 　　[关键词] 葛根素；软骨细胞；细胞增殖；细胞培养 　　[中图分类号] R684.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）12（b）-0024-03 　　骨性关节炎是一种常见的骨关节疾病，以软骨变性为特征。软骨细胞过度凋亡在骨性关节炎的发生发展中起着重要作用[1]。研究表明，IL-1β在改变正常软骨细胞结构、抑制软骨细胞基质的合成、促进软骨细胞的凋亡等发面发挥重要作用[2-3]。葛根素（Puerarin，Pue）是中药葛根的提取物，也是葛根的主要有效成份之一。笔者前期研究证实，葛根素能够抑制基质金属蛋白酶-1（MMP-1）的生成，从而起到抑制细胞外基质中胶原的降解、减缓骨性关节炎的病程进展的作用[4]。本研究从软骨细胞着手，通过细胞培养研究葛根素对IL-1β损伤大鼠关节软骨细胞增殖的影响，旨在理论上阐明葛根素治疗膝骨性关节炎的相关机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要材料及设备 　　SPF级10日龄大鼠（武汉同济医学院实验动物中心提供）、CO2恒温培养箱（日本SANYO公司）、超净工作台（苏净安泰）、生物倒置显微镜（重庆光电仪器总公司）、台式离心机（Heal Force）、酶标检测仪（美国Rayto公司）、光学显微镜及照相系统（重庆光电仪器有限公司）。 　　1.2 主要试剂 　　DMEM/F12培养基（美国Hyclone公司）、胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）、胰蛋白酶（Amresco公司）、Ⅱ型胶原酶（北京博奥森生物技术有限公司）、噻唑蓝（MTT，AMRESCO Inc公司）、重组大鼠白介素-1β（rratIL-1β，PeproTech公司）、地塞米松磷酸钠注射液（Solarbio公司）；葛根素标准品（Sigma公司）、4%中性缓冲福尔马林、无钙镁磷酸缓冲液（PBS）、二甲基亚砜（DMSO，AMRESCO Inc公司）、Ⅱ型胶原抗体（北京博奥森生物技术有限公司）、免疫组化试剂盒（Dako Denmark A/S公司）、DAB显色试剂盒（Dako Denmark A/S公司）。 　　1.3 软骨细胞的培养及鉴定 　　1.3.1 软骨细胞的原代培养 取SPF级10日龄大鼠，脱颈处死后，在无菌条件下取出髋膝关节处的软骨组织块，于超净工作台内置入含10%双抗的PBS培养皿中，清洗1遍，再用不含双抗的PBS清洗3遍。然后将软骨组织块移入EP管，向EP管中滴入2～3滴PBS，然后用眼科剪将组织块剪至约1 mm3大小。将EP管中的PBS吸出，加入0.2%Ⅱ型胶原酶使组织块处于悬浮状态，置于37℃条件下消化过夜。消化完成后，将EP管在振荡器上振荡2 min，使消化下来的细胞从组织中离散。离心弃上清，取出下层细胞加入盛10%胎牛血清的DMEM/F12培养瓶中，置于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养。72 h后更换培养液，观察细胞生长情况，以后隔2 d更换1次培养液，当细胞长满单层的80%～90%后进入传代培养。 　　1.3.2 软骨细胞的传代培养 将培养瓶中的培养液吸弃，用PBS冲洗2遍，加入0.25%胰蛋白酶2 mL消化5 min左右，在倒置显微镜下见细胞变圆后，立即弃去消化液终止消化，加入含血清的培养液冲洗、吹打，使细胞悬浮起来，根据需要调节细胞浓度分瓶接种于新的培养瓶中。置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。 　　1.3.3 软骨细胞的鉴定 Ⅱ型胶原是软骨基质中的一种结构蛋白，是软骨细胞的特征性分泌产物。软骨细胞经Ⅱ型胶原免疫细胞化法检测