链霉菌I06A—02580发酵产物分离提取及其结构鉴定.docVIP

链霉菌I06A—02580发酵产物分离提取及其结构鉴定 　　[摘要] 目的 从链霉菌I06A-02580中提取分离和纯化小分子血管内皮细胞生长因子（VEGF）受体抑制剂，并进行结构鉴定。 方法 以酪氨酸酶活性测定方法即酶联免疫吸附测定法（ELISA法）为活性跟踪方法，利用大孔吸附树脂方法、高效液相色谱（HPLC）等方法进行分离纯化。利用紫外（UV）、红外（IR）、质谱（MS）和核磁共振（NMR）四谱联合分析，进行结构解析。 结果 分离纯化到两个已知化合物大豆苷元和染料木素并具有相关活性。 结论 大豆苷元和染料木素为已知化合物，大豆苷元对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌有抑菌作用；染料木素有抗真菌的作用。该研究为首次报道该化合物具有VEGFR拮抗活性。 　　[关键词] 血管内皮细胞生长因子；分离纯化；结构鉴定；抗肿瘤 　　[中图分类号] R915 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）06（c）-0021-03 　　血管内皮细胞生长因子（VEGF）是一种糖基化分泌性多肽因子，是作用最强的促血管生长因子[1]，血管内皮细胞生长因子受体（KDR）是介导VEGF在肿瘤新生血管形成中发挥功能的特异性受体[2]。恶性肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤血管新生，VEGF和KDR在正常组织中少量表达，在恶性肿瘤组织中的表达高于良性，且随着恶性程度的进展，VEGF和KDR的表达增加[3]。VEGF受体KDR既表达于肿瘤新生血管内皮细胞， 又表达于大部分恶性度较高的肿瘤细胞[4]，因此，以肿瘤血管为靶点，采用各种途径抑制肿瘤血管的形成，能有效抑制肿瘤生长和转移[5]。KDR由含7个胞外Ig样结构域、1个单一短链跨膜系列和1个具受体酪氨酸激酶活性的胞内区（KDR-CD）组成。美国学者Jame等[6]和Genshi等[7]的研究表明，KDR抑制剂对KDR-CD同样具有抑制活性，并认为以KDR-CD作为靶点建立高通量酪氨酸激酶抑制剂筛选模型是可行的，但目前相关的研究结果报道较少，微生物来源的酪氨酸激酶抑制剂研究也较少。有研究发现VEGFR抑制剂可促进肿瘤细胞凋亡，使其活力下降，目前已有多个酪氨酸激酶抑制剂药物上市，如舒尼替尼（Sunitinib）、阿西替尼（Axitinib）、西地拉尼（Cediranib）、二磷酸莫替沙尼（Motesanib）、帕唑帕尼（Pazopanib）、伐地他尼（Vandetanib）、索拉菲尼???Sorafenib）、瓦他拉尼（Vatalanib）等。本研究采用本所生物工程室以KDR-CD蛋白为靶位，建立的VEGF受体抑制剂筛选模型对菌种I06A-02580的次级代谢产物进行了研究。 　　1 材料与仪器 　　1.1 菌种 　　链霉菌 I06A-02580 由中国医学科学院医药生物技术研究所菌种保藏中心提供。 　　1.2 试剂和材料 　　X-5大孔吸附树脂（天津南开大学化工厂）；葡聚糖凝胶 LH-20（上海化学试剂厂，进口分装）；丙酮，甲醇等均为北京化工厂生产，分析纯；乙腈（SK Chemicals 公司，色谱纯，韩国）。 　　1.3 仪器 　　傅里叶变换红外光谱图仪（nicolet5700，热电公司，美国）；质谱仪（LTQ-Orbitrap赛默飞世尔，美国）；核磁共振仪（Varian VNS-600 型 600M，瓦里安公司，瑞士）；中压液相色谱仪（EPCLC AI-580S，山善公司，日本）；中压液相色谱柱（ODS-SM-50B，26 mm×300 mm，山善公司，日本）。高效液相色谱仪（Agilent 1200A，安捷伦公司，美国）；半制备色谱柱（9.4 mm×250 mm，5 μm，安捷伦公司，美国）；分析色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm，安捷伦公司，美国）；紫外光谱仪（UV 2550 型，岛津公司，日本）；高速离心机（6-16K，SIGMA公司，德国）；恒温摇床（HZQ-Q 型，江苏金坛市环宇科学仪器厂，中国）；无菌工作台（SANYO MCV-B161Sb（T），三洋电气公司，日本）；电子分析天平（HANGPING FA 1004 上海天平仪器厂，中国）；旋转蒸发仪（Buchi-011，瑞士）；冷冻干燥仪（Alphr 2-4 lscChirst 公司，德国）。 　　2 方法与结果 　　2.1 菌种I06A-02580的发酵 　　链霉菌I06A-02580于斜面培养基培养7 d（28℃）。无菌操作下，将生长于新鲜斜面的I06A-02580挖块接种于100 mL种子培养基于500 mL摇瓶中，28℃，250 r/min旋转震荡48 h。二级发酵：无菌操作下，以5%的接种量将种子培养液转种于装有1 L液体培养基的5 L玻璃摇瓶中，28℃，250 r/min摇床培养96 h