干血片苯丙氨荧光测定法.pptVIP

干血片苯丙氨酸荧光测定法 佛山市新生儿疾病筛查中心 刘海平 一、苯丙酮尿症筛查的实验方法 自从1934年挪威Folling报告苯丙酮尿症（PKU）后，实验检测方法也越来越多，越来越先进，最早的是1961年美国的Guthrie建立的三氯化铁试验。 一、苯丙酮尿症筛查的实验方法 目前用于PKU筛查的方法主要有：1.???? 细菌抑制法2.???? 荧光分析法3.???? 酶法4.???? 高效液相色谱法5.???? 氨基酸分析法6.???? 高效毛细管电泳法目前我国苯丙酮尿症筛查的实验方法主要是细菌抑制法和荧光分析法。我们省大都使用荧光分析法。 苯丙氨酸 荧光测定法 一、原 理 1、原 理 苯丙氨酸的荧光测定法是McCaman和Robins在1962年建立的测定法，故又称McCaman和Robins法。 四十年来不断改正和完善，现已有专门的荧光检测仪及相配套的试剂盒。 它比细菌抑制法更灵敏、更快速、操作更方便。绝大多数国家和地区使用此方法，并延续至今。 1、原 理 从干滤纸血片上先提取出的苯丙氨酸，与茚三酮形成一种荧光化合物。 1、原 理 加入二肽L亮氨酸—L丙氨酸后可大大提高此荧光反应。 1、原 理 加入铜试剂稳定荧光复合物并终止反应，在485nm波长处测定荧光强度。激发光波长390nm。 其苯丙氨酸含与荧光强度成正比，即苯丙氨酸含量越高荧光强度则越强，通过检测已知浓度的标准血斑的荧光值并绘制曲线则可求得各样本的苯丙氨酸浓度。 2、特点 ：①荧光物质苯丙氨酸—茚三酮复合物，吸收特定波长（390nm）的光能后，发生原子重排，同时发射出波长（485nm）更长的光。 2、特点 ②荧光法测定苯丙氨酸含量结果可靠，批内和批间变异系数(CV)均小于10％。 ③商业试剂盒的苯丙氨酸检测低限为0.5mg/dl (30umol/L)。 ④血胆红素浓度小于200umol／L时对实验结果无干扰。 2、特点 ⑤通过严格控制pH值可最大程度地降低其他氨基酸的干扰。 在pH5.8土0.1条件下，L甲硫氨酸、L半胱氨酸、L谷氨酸、L组氨酸、L亮氨酸和L—甘氨酸对L苯丙氨酸含量的测定无影响。 然而在高pH，例如pH6.5条件下，其他氨基酸均会产生干扰，荧光强度明显减低。 2、特点 各种改进后的荧光测定法（McCaman和Robins法）已广泛用于血清和干血滤纸标本中的苯丙氨酸定量测定。 由芬兰Labsystems公司首先推出基于现代微量反应板的荧光测定法（McCaman和Robins法）测定干血斑中苯丙氨酸含量的方法，适用于大规模新生儿疾病筛查。 二．仪器和试剂 1、仪器 1、仪器 ①、荧光读数仪；②、孵育／振荡仪；③、3mm打孔器，或打孔钳；④、加样器；八道加样器。以上仪器均由芬兰Labsystems公司提供。⑤、3mm实验血片塑料支架；⑥、电脑、打印机；⑦、冰箱。 2、试剂 2、试剂 ①琥珀酸缓冲液（1） ：pH5.8土0.1，加入0.05％Bronidoxe(作为防腐剂)； 2、试剂 ②.L-亮氨酸L—丙氨酸溶液（2）：加入0.05％Bronidoxe(作为防腐剂)； 2、试剂 ③.水合茚三酮（3）：水合茚三酮溶液； 2、试剂 ④.铜试剂（4）：无水硫酸铜、酒石酸钠钾和碳酸钠溶液； 2、试剂 ⑤.标准品（5） ：含5种不同苯丙氨酸浓度(mg/d1)的干滤纸标准血斑。存于装有干燥剂的铝箔袋中； 2、试剂 ⑥质控品（6） ：含有2个质控品的l张滤纸，存于装有干燥剂的铝箔袋中； 2、试剂 ⑦白板（7） ：白色板(12*8孔)。平底，聚苯乙烯；⑧酶标板覆盖物：在保温和洗脱期间均使用塑料薄膜将板覆盖； 2、试剂 ⑨质控品和标准品的苯丙氨酸浓度数值的卡片及说明书； 2、试剂 三、实验操作 3．实验操作步骤 (1)做好实验登记，包括检测日期、检测区间、复查样本号等。 编写好实验操作卡；把本次实验要做的标准、质控、复查标本、重查标本及常规标本的卡片号用不同的颜色写在操作卡，看上去一目了然，严防打孔时张冠李戴。 佛山市新生儿疾病筛查中心实验操作卡 检测项目: PKU 检测时间: 2003年11月11日 操作者： 3．实验操作步骤 (2)对照实验操作卡用打孔器在滤纸上围绕血斑园心与边缘的中点打下直径3mm的标准品和质控物(双孔)、复查和标本(单孔)，并依次放置到洁净的白色板孔内。(3)每孔加入80ul的80％乙醇溶液，用塑料粘胶盖密封酶标板孔，室温振荡(900转／分)30分钟。 3．实验操作步骤 (4)用多道加液器转移50ul洗涤液至另一块白色酶标板内。如果采用塑料血片支架打孔，则洗脱30分钟后将血片与支架一起去除即可，无须移液。 3．实验操作步骤 3．实验操作步