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基因工程抗体片段 ----谱写抗体家族的新乐章 基因工程抗体片段之前奏曲———小分子抗体 第一代小分子抗体———抗原结合片段( fragment with antigen binding，Fab) 和重组Fab Fab 片段由完整轻链和重链的VH + CH1构成，其大小为完整抗体的1/3,约55KD； 重组Fab 是将轻、重链可变区分别与人抗体的κ 链和重链CH1重组； Fab 基因工程构建方法及其性能 通常是保留鼠源性的CDR区, 其余换成人源化,通过大肠杆菌以分泌表达的方式表达L链和Fd链, 二者能在细菌的外周质腔中折叠成具有一定构象的Fab； 该Fab具有抗体的活性。因为其不含有Fc段、分子量小、结合力高、抗原性低, 故在肿瘤治疗上有其优越性。目前已有多个片段药物获得FDA批准上市. Fab的临床应用 1）阿昔单抗( abciximab，ReoPro) 1994 年12 月FDA 批准的第一个重组Fab 片段，该产品以血小板糖蛋白Ⅱb /Ⅲa 为靶点，用以防止血小板聚集及血栓形成，作为冠状动脉导管插术时预防心肌缺血的辅助用药，取得了巨大的成功； 2）兰尼单抗( lucentis)：治疗黄斑变性， 2006 年获得FDA 的批准。 3）赛妥珠单抗( cimzia)：克罗恩病和风湿性关节炎，2008 年获得FDA 的批准。 在临床研究中，Fab 占据了临床研发抗体片段的大多数( 30 /54 种) 。 第二代小分子抗体———单链抗体( single chain Fv，ScFv) ScFv指在重链V区cDNA5’端与轻链V区cDNA5’端之间用一寡聚核甘酸连接, 在大肠杆菌中表达成一单链多肽, 并在细菌体内折叠成只由重链和轻链可变区构成的一种新型的抗体, 大小仅为完整Ig的1/6(约28KD); 是含有完整抗原结合部位的最小抗体片段； ScFV的功能 1）用于治疗：可进人一般抗体不能达到的部位, 如蛋白偶联受体、酶活性部位和病毒表面的腔囊等； 2）多肽接头可设计为具有特殊功能的位点：多肽接头是单链抗体的独特组成,可设计为具有特殊功能的位点：如金属赘合、连接毒素或药物等, 用于影像和临床治疗； 第三代小分子抗体———纳米抗体和分子识别单位( molecular recognition unit，MRU) 1. 纳米抗体主要指仅由一个重链可变区组成的单域抗体( VHH)，其体积约为完整抗体的1 /10，故称为纳米抗体； 纳米抗体的来源 1993 年Hamers 等偶然发现骆驼体内存在一 种仅具有重链的抗体，被称为重链抗体( heavy-chain antibodies，HCAbs) 。此后，在一些软骨鱼，如护士鲨体内也发现类似骆驼重链抗体结构的新抗原受体( new antigen receptor，NAR) 。 这类抗体的抗原结合位点仅由重链的可变区VHH( variable domainof the heavy chain of HCAbs，VHH) 单结构域形成，尽管缺失轻链可变区，却仍具有良好和广泛的抗原结合力； 克隆这种抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体( VHH)。 纳米抗体单域的性质 1）有高度水溶性和构象稳定性：尽管缺失轻链可变区，却仍具有良好和广泛的抗原结合力。并且由于在框架FR2 区存在一些不同于常规抗体的亲水性氨基酸，使得VHH 抗体在水溶液中具有良好的稳定性。 在苛刻的条件中，如胃液和内脏中仍能保持抗原结合活性，为口服治疗胃肠道功能紊乱性疾病提供新的思路； 2）纳米抗体能识别独特的抗原表位，由于具有伸展的抗原互补结合区( CDR) 以及更高的组织穿透性和更小的分子，VHH抗体可以结合一些常规抗体无法接近的抗原表位。可进入酶的活性部位及细菌或病毒表面受体裂缝中，可以利用其模拟药物来设计小分子酶的抑制剂、受体的激动剂或拮抗剂等； 3）能有效地穿过血脑屏障：有望成为治疗神经性疾病和脑肿瘤的新药 VHH稳定的机制 传统抗体的VH 和VL 区通过疏水作用形成稳定结构，而重链抗体则通过选择性突变VHH 胚系基因中几个功能位点，使其形成较高的亲水性表面，可在缺失VL 条件下保持结构稳定； VHH 胚系基因序列特性 1）对骆驼VHH 胚系基因序列分析发现，VHH 与人源VH 基因Ⅲ家族序列具有较高的同源性； 2）比较人类和骆驼IgG 重链可变区发现，在框架FR2 区的氨基酸组成中，有4 个氨基酸显著不同。这4 个氨基酸在VH 和VHH 中分别是V42F 或V42Y，G49E，L50R 和W52G，， 利用这一特点, 可以对人源抗体VH 结构域FR2 中的一些氨基酸进行VHH特征性改造, 所得到的骆驼化