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核黄素定量测定法课件9
荧光光度法 定量测定核黄素方法 一 实验原理 核黄素（维生素B2）是一种异咯嗪衍生物。在水及乙醇的中性溶液中为黄色，并且有很强的荧光，这种荧光在强酸和强碱中易被破坏。核黄素可被亚硫酸盐还原成无色的二氢化物，同时失去荧光，因而样品的荧光背景可以被测定。二氢化物在空气中易重新氧化，恢复其荧光，其反应式见讲义. 另外,核黄素的激发光波长范围约为440—500nm(一般规定为440nm),发射光波长范围约为510—550nm(一般规定为520nm)。利用核黄素在稀溶液中荧光的强度与核黄素的浓度呈正比，由还原前后的荧光差数可以进行定量测定。根据核黄素的荧光特性亦可进行定性鉴别。 二 实验目的和要求 （1）、了解荧光法测定核黄素的原理和方法。 （2）、学习荧光光度计的操作和使用。 （3）、掌握荧光定量分析的工作曲线。 三 实验主要仪器与器材 3-1、实验仪器： (1) 、 荧光光度计 (2) 、 混合器 （3） 、 天 平 （4） 、 水浴锅 3-2、实验器材 (1)、 容量瓶 (2)、 试管架 (3)、 试 管 （4）、 自动取液器 （5）、 烧 杯 （6）、 量 筒 （7）、 称量纸 （8）、 吸水纸 （9）、 骨 勺 （10）、保鲜膜 （11）、标签纸或记号笔 四 试剂与配制 4-1、试剂 (1)、连二亚硫酸钠（保险粉） (2)、核黄素 (3)、醋 酸 4-2、试剂配制 (1)、连二亚硫酸钠（保险粉），直接用. (2)、36%醋酸溶液的配制： 取冰醋酸36.0毫升,用蒸馏水稀释至100.0毫升， 混匀即可。 (3)、核黄素标准品母液（10.0ug/ml）的配制： 准确称取核黄素10.0毫克，放入预先装有50.0毫升 蒸馏水的1000.0毫升容量瓶中，加入5.0毫升36%醋 酸溶液，再加约800.0毫升蒸馏水，置水浴中避光 加热直至溶解。冷却至室温,用蒸馏水再定容至 1000.0毫升，混匀即可。 五 操作步骤与结果 5-1 荧光测定方法 （1）、选用滤色片 核黄素荧光测定的激发光波长为455nm，选用带普通型 400nm滤色片为激发光滤色片发射波长为523nm，选用截 止型510nm滤色片为发射光滤色片. （2）、调仪器满刻度 待仪器预热后，用2.5ug/ml（含量最高的）的溶液调荧光 光度计相对荧光强度，既调读数到满刻度（100%），反复 多次，直至数据稳定为止。调好的满刻度，在整个实验结 束之前，不可随意重调满刻度。 （3）、标准品和样品测定 A、未还原时标准品和样品溶液荧光强度的测定（ F1 ） 从高浓度到低浓度依次测定,并记录各自的读数于表1中, 测定完后必需重新倒回到各自的原试管内 ,供样品溶液 还原用. B、还原后标准品和样品溶液荧光强度的测定 （F2 ） 分别加入连二亚硫酸钠（保险粉）约10.0毫克,经溶解 混匀后，再重新测其各自荧光强度，并记录读数于表1中, 在测定中如果样品溶液的荧光强度超出100%，则需要重 新稀释。仪器预热20
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