可行性研究报告(新)(论文资料).docVIP

辽宁省科技攻关层次计划（JH2）项目可行性研究报告 腰椎间盘退变动物模型的建立及生物技术治疗 贾长青 中国医科大学附属第二医院第一骨外科 项目提出的目的及意义 本课题将依据目前椎间盘退变发生机制的研究进展和进展趋势，以腰椎间盘退变模型为对象，探讨基因治疗的可行性。研究表明，在椎间盘退变的早期在分子水平的基因治疗逐渐显现出其优越性。随着各种途径的深入和完善，椎间盘疾病基因治疗的条件已趋于成熟。本课题设计运用TGF-β1基因修饰腰椎间盘退变模型的骨髓间充质干细胞，经TGF-β1转染体外培养的骨髓间充质干细胞后，将转染成功的干细胞鉴定、筛选、扩增后移植入自体退变的椎间盘中对其进行基因治疗，相类似的实验研究未见报道。该研究，可使现有基因治疗中安全性、稳定性、免疫活性等方面的不足得到不同程度的改善；将是基因治疗椎间盘退变的一条新途径。为临床逆转椎间盘退变，防止腰椎间盘突出症的发生提供理论基础和实验依据。 椎间盘退变是椎间盘突出症及腰腿痛的主要原因。流行病学调查发现，80%的人会经历一次或以上的腰痛，其中5%的人长期受到慢性腰痛的困扰。椎间盘退变是困扰我国人民健康的难题之一，它引起的腰腿痛给病人和社会都造成了沉重的负担。目前，椎间盘退变疾病的治疗主要为保守治疗和手术治疗。保守治疗为目前临床治疗的主要方式，但远期效果不佳。手术治疗后，椎间盘的生物学环境发生改变，相邻节段退变加速。近期效果佳，但远期效果需进一步观察。 近年来，随着分子生物学、遗传学、免疫学、组织工程学的发展及其在临床医学中的应用，在椎间盘退变的早期，针对其分子水平生物治疗的优越性越发显现。然而，从事此类研究的关键步骤之一是椎间盘退变实验动物模型的构建和制备，通过实验干预或自发过程，在实验动物体内模拟并观察分析椎间盘退变的过程，从而为椎间盘退变的病因学研究提供参考依据，进而可对椎间盘退变的生物学治疗进行准确评估。 二、与项目相关的国内外发展概况及市场需求分析 为了椎间盘退变的早期干预与修复，国内外学者做了大量的探索。研究表明，细胞因子能够增加椎间盘局部细胞外基质的合成，缺乏细胞因子或细胞因子合成水平降低会导致髓核内蛋白多糖的降解增加、合成减少，蛋白多糖的绝对量减少，继而引起椎间盘退变。Thompson〔1〕 报道了细胞因子对成年狗椎间盘培养细胞的影响，是最早探索用细胞因子诱导退变椎间盘修复的研究之一。生长因子、巨噬细胞、肥大细胞在受损椎间盘纤维环的修复及技法的椎间盘退变中起重要作用〔2〕。Wenger KH〔3〕等的研究表明，在纤维软骨凋亡中，常压下细胞外基质基因的正调节更关注于一般活动的生物力学重要性，而高压下二种主要胶原的分化调节显示了纤维环在病理力学环境下重塑的能力。Sox9基因是Ⅱ型胶原合成过程中一个重要的转录因子，其在软骨的发育、成熟过程中对Ⅱ型胶原基因表达增强和促使Ⅱ型胶原合成增加的作用已十分明确〔4〕。椎间盘软骨样细胞主要分泌基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）如： MMp-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9〔6、7〕。它们是椎间盘基质的主要降解酶，参与突出椎间盘的自然吸收过程。白细胞介素-1（interleukin-1,IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）、前列腺素E2(PLE2)能促进其合成；转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）、胰岛素样生子因子-1（insulinlike growth factor-1,IGF-1）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,FGF）等生长因子抑制其合成〔7-10〕。椎间盘及其环境、细胞和其产物复杂的内部反应、髓核内部合成和分解代谢失衡都直接导致椎间盘的退变，从而为椎间盘基因治疗提供两条不同的途径，即主要选择细胞因子和致炎因子拮抗剂作为基因治疗的目的基因。生长因子在离体间接实验中能使胶原及蛋白多糖的合成增加〔11〕。Nishida〔12〕用腺病毒介导的半乳糖苷酶（Lac-Z）基因进行了体内和体外实验，结果腺病毒载体能高效地将Lac-Z基因转导入髓核细胞，在随后的研究中证明相应蛋白的表达可以持续1年之久。之后不久，在体直接向椎间盘细胞导入治疗基因TGF-β1取得成功〔13〕。Moon〔14〕把患者的椎间盘细胞体外培养后利用Ad/CMV-Lac-Z载体直接转导，转导率100%。腺病毒介导的TGF-β1在随后的研究中也成功地转入体外培养的人椎间盘细胞，其表达及蛋白多糖和胶原的合成都得到增加〔17〕。另有研究表明，组织基质金属蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP-1)可以作为一个有效的因子对椎间盘退变的过程进行高效率的调