泛素融合对EB病毒核抗原IDNA免疫效果的影响课件.ppt

研究背景 研究背景 研究背景 研究背景 CTL在机体免疫反应中作用 越来越多的证据表明:细胞内感染和肿瘤的保护性免疫并非主要依赖于中和抗体而是依赖于细胞毒性Ｔ细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)的应答。细胞免疫尤其是CD8+CTL细胞亚群在抗胞内寄生菌、病毒、某些真菌感染及抗肿瘤免疫中起着十分重要的作用。 CTL在DNA疫苗免疫中的意义 能诱发强大CTL反应的疫苗现已被公认为在控制许多胞内病原的感染方面有着美好的前景。 DNA疫苗进入机体后，在宿主细胞内合成靶抗原，经加工后，由MHC-I类途径递呈，可有效激活机体产生CD8+CTL。 研究背景 小 结（1） 分别扩增了突变的Ub和EBNA1基因。两者融合后（Ub-Ala/Arg-EBNA1）的基因测序分析表明：序列与预期结果一致。 镍离子亲和柱纯化的25-kDa EBNA1免疫Balb/C小鼠后，制备了鼠抗25-kDa EBNA1血清，抗体滴度大于1:6400。 小 结（2） 诱导表达和纯化了Mr 2.5×104左右的融合蛋白（25-kDa EBNA1）。制备了鼠抗25-kDa EBNA1血清。免疫印迹显示，该蛋白能被鼻咽癌（NPC）病人血清和鼠抗25-kDa EBNA1血清特异性识别。 小 结（3） ●成功地构建了单基因和融合基因的真核表达质粒。均能有效表达目的蛋白。 ●鼠抗25-kDa EBNA1血清能够识别HeLa细胞中瞬时表达的全长EBNA1蛋白。 小 结（4） 单基因和融合基因免疫Balb/C小鼠后能够诱生针对EBNA1 特异性的抗体和CTL反应。二者诱生抗体的效率无明显差别，但泛素的融合使得针对EBNA1的特异性CTL反应明显增强。 1、Ub增强EBNA1细胞免疫的分子机理的探讨。 2、调制细胞内EBNA1的半衰期的方法探索。如：酶E3，药物 3、25-kDa EBNA1蛋白及其抗血清的应用 第二部分 EBNA1 的原核表达、蛋白纯化及抗体制备 实 验 设 计 构建原核表达质粒pET30a-EBNA1和pET30a-SS580 酶切鉴定 转化 BL21(DE3)细菌 诱导表达分析 镍离子亲和柱纯化 免疫小鼠 采集血清 ELISA测定抗体滴度 Western blot检测 25-kDa EBNA1蛋白的表达与纯化 图 25-kDa EBNA1蛋白的western blot鉴定 A. SDS分析 B. 鼠抗25-kDa EBNA1血清 C. 鼻咽癌病人血清 1. 蛋白质分子量标准 2. 未诱导对照 3. 诱导后的表达 4. 纯化后的蛋白 1 2 3 4 B A 1 2 3 4 1 2 3 4 C kDa 97.4 66.2 43.0 31.0 20.1 kDa 97.4 66.2 43.0 31.0 20.1 kDa 97.4 66.2 43.0 31.0 20.1 第三部分 EBNA1和Ub-EBNA1真核表达质粒的 构建及表达 分析 实 验 设 计 构建pCI-EBNA1和pCI-Ub-EBNA1真核表达质粒 酶切鉴定 瞬时转染HeLa细胞 表达分析 间接免疫荧光检测 Western blot检测 M 1 2 3 4 bp 2000 1000 750 500 250 100 Lane M. DL2000 1. pCI-EBNA1/SmaⅠ 2. pCI-EBNA1/XbaⅠ 3. pCI-EBNA1/EcoRⅠ 4. pCI / EcoRⅠ 图 pCI-EBNA1质粒酶切鉴定 Fig. Restriction endonuclease digestion map of plasmid pCI-EBNA1 M 1 2 3 4 5 bp 2000 1000 750 500 250 Lane M. DL2000 1. pCI-Ub-EBNA1/ SmaⅠ 2. pCI-Ub-EBNA1/EcoRⅠ+ SalⅠ 3. pCI-Ub-EBNA1/BglⅡ 4. pCI-Ub-EBNA1/EcoRⅠ 5. pCI/EcoRⅠ 图 pCI-Ub-EBNA1质粒酶切鉴定 Fig. Restriction endonuclease digestion map of plasmid pCI-Ub-EBNA1 B 1 2