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凝胶过滤层析gel filtration chromatography,GFC 定义 凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻层析（size exclusion chromatography）、分子筛层析（Molecular Sieve Chromatography）、凝胶渗透层析（Gel Permeation Chromatography） 应用 凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。 分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。 利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、去热源和脱色。 原理 凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。 当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，首先流出层析柱； 相对分子质量较小的物质可自由地进出凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。 中等大小的分子在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。 这样，经过层析柱，混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。 固定相（凝胶） 三维空间网状结构 基本概念 外水体积(Vo)是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。 内水体积(Vi)是指凝胶颗粒中孔穴的体积。 基质体积(Vg)是指凝胶颗粒实际骨架体积。 柱床体积(Vt)就是指凝胶柱所能容纳的总体积。 洗脱体积(Ve)是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积 分配系数（Kd） 每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数 典型的凝胶类型 交联葡聚糖凝胶：Sephadex?? 聚丙烯酰胺凝胶：Sephacryl ?? 琼脂糖凝胶：Sepharose和Bio-Gel?? 其它：有机凝胶Sepharon，交联聚醚Toyopeal，纤维素凝胶，改性刚性填料等 葡聚糖凝胶 葡聚糖凝胶（Sephadex）具有良好的化学稳定性，是目前生化产品制备中最常用的凝胶。 基本骨架：葡聚糖（dextran）;交联剂：3-氯-1 ,2-环氧氯丙烷使葡聚糖之间通过醚键交联聚合而成的三维空间网状结构 葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。交联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越小。交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大 葡聚糖凝胶 1．理化性质 葡聚糖凝胶的外观为白色珠状颗粒。 它带有大量的羟基，亲水性好，因此在水溶液或电解质溶液中极易膨胀。 由于各种型号的葡聚糖凝胶的交联度不同，致使如下理化性质在水中的有明显的差异： 膨胀度(床体积) 吸水量(每克干凝胶在水中充分膨胀时所需的水量) 筛孔的大小 分级范围 葡聚糖凝胶的型号不同，其性质亦不一样 分类 以G型葡聚糖凝胶(经水溶液膨胀)作为固定相，以水溶液作为流动相，对水溶性物质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶过滤层析。 以LH型葡聚糖凝胶(经乙醇或二甲亚砜甲酰胺或N、N-二甲基甲酰胺等有机溶剂膨胀)作为固定相，以有机溶剂为流动相，对脂溶性物质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶渗透层析。 2．稳定性 葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中是稳定的、不溶解的，而且很少产生化学降解。 在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可置高温(120℃)消毒0.5h，其性质并不改变。 在0.1mol／L HCl溶液中浸泡1~2h，甚至在0.02mol／L HCI溶液中浸泡6个月以上，对分离效果无明显的影响。 当暴露于强酸或氧化剂溶液时，则容易使糖苷键水解断裂，因此，要避免与其接触。 葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加入适量的防腐剂如氯仿、0.05％NaN3或20％乙醇等，不然微生物将生长。 3．吸附性 葡聚糖凝胶系弱酸性物质，这是由于其每克干胶中含10-20μg当量的羧基基团所致。 羧基基团能与分离物中电荷基团 (尤其是碱性蛋白质)发生吸附作用。 这种吸附作用可以借助提高洗脱液的离子强度得以克服。 当离子强度大于0.05时，一般对弱碱性蛋白质就无吸附力了。 因此，常用含有NaCl的缓冲液作洗脱液。 琼脂糖凝胶（商品名为Sepharose) 琼脂糖是从琼脂中分离出来的。 在制备过程要将其中含硫酸根和羧基基团的琼脂胶除去，得到不带电荷基团的琼脂糖。 琼脂糖是由D-半乳糖和3、6脱水的L-半乳糖连接构成的多糖链。 这种多糖链在100℃左右时呈液态，当温度下降到45℃以下时呈固态。 它们之间以氢键方式相互连接就成了线性的双链单环的琼脂糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。 该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较