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从RNA提取到荧光定量完整解决方案课件
模板准备 引物设计 浓度确定 环境要求 误差控制 RT 样品制备 数据分析 上机 核酸制备区 反应液制备区 制作标准曲线 设定浓度区间 评价引物 使用mix降低系统误差 设置重复(≥3次) 设置空白和阴性对照 均一的反应液和模板混合物 GC%:50-60% Tm:50-65℃ 单个碱基重复<4个 无二级结构 扩增长度:100-200bp 反应体系优化 上机 反应条件优化 RT 样品制备 模板准备 数据分析 反应体积>5ul,推荐20-50ul Mg2+调节,酶活调节 引物浓度优化,模板量优化 退火温度优化:梯度PCR 延伸时间:产物长度决定 扩增效率:90%-110% 重复性:std<0.2 标准曲线:R>0.99或R2 >0.98 SYBR法实验流程及注意事项 标准品 待测样本 阳性对照 阴性对照 技能要求 误差控制 仪器介绍 上机 试剂选择 RT 样品制备 模板准备 数据分析 自配 realmastermix RCHO-Lightcycler series ROTOGEN-RG series BIO-RAD Opticon series ABI-7series Bioer-Linegene series 分装控制 内参控制 机器校正控制 平滑曲线,重复性好,灵敏度高 SYBR法实验流程及注意事项 数据分析 仪器介绍 分析方法 上机 RT 样品制备 模板准备 相对定量:2-△△Ct法 绝对定量:标准曲线法 可靠,准确的数据 SYBR法实验流程及注意事项 内容概要 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法 绝对定量分析方法简介 相对定量分析方法简介 化学合成目的基因 将PCR扩增产物直接梯度稀释 已知拷贝数的质粒DNA和体外 转入的RNA 纯度高,定量准确 受化学合成工艺限制, 只能合成120bp以下长度 方便、简单, 不准确、不稳定; 稳定,准确 绝对定量简介 标准样品的制备 绝对定量简介 拷贝数的计算 待测样本浓度(ng/ul)=OD260×40×稀释倍数 样本分子量=碱基数×324 待测样本拷贝数(copies/ul)=待测样本浓度/样本分子量×6×1014 倍比梯度稀释方法: 1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液,得标准品ii 1v标准品ii+9v稀释缓冲液,得标准品iii 1v标准品iii +9v稀释缓冲液,得标准品iv 1v标准品iv +9v稀释缓冲液,得标准品v 扩增效率(E):扩增效率与标准曲线的斜率相关:E=10-1/斜率,理论的扩增效率理论值应该为2,即每 一个循环的PCR产物都翻倍,那么2=10-1/斜率,优化的标准曲线斜率应该为-3.32 E用每个循环扩增模板百分比表示即:En(%)=(E-1)×100% 例如E=1.95,那么E%=(1.95-1)×100%,即每次循环有95%模板被扩增 扩增效率概念 绝对定量简介 绝对定量举例:HBV病毒检测 Sample: HBV阳性标准品,分别含有5×103、5×104、5×105、5×106 copies /ml None None BLANK 0.10 18.77 18.92 18.63 5×106 0.12 22.28 22.46 22.11 5×105 0.04 25.19 25.14 25.25 5×104 0.16 28.41 28.64 28.18 5×103 STD Mean Ct Ct2 Ct1 copies/ml 实验数据: 绝对定量简介 标准曲线制作举例 扩增效率(E)计算 E=10-1/斜率 =10-1/-3.17 =2.03 En=(2.03-1) ×100% =103% 标准曲线制作:利用MeanCt作图可得到标准曲线 y = -3.17x + 37.52 R2 = 0.9988 标准曲线制作举例 如未知样本Ct为20.5 标准曲线制作:利用MeanCt作图可得到标准曲线 将Ct值带入线性方程: 20.5= -3.1726 X + 37.52 X= 20.5-37.517 -3.1726 =5.36 QuantityUnknown=105.36 =229087 copies y = -3.17x + 37.52 R2 = 0.9988 内容概要 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法 绝对定量分析方法简介 相对定量分析方法简介 分析方法
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