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枇杷AS—PCR反应体系建立和优化 　　摘 要： 【目的】建立和优化枇杷AS-PCR反应体系，为开展枇杷S基因快速鉴定奠定基础。【方法】以‘大五星’、‘早钟6号’和‘龙泉5号’为试材，通过正交实验设计对影响枇杷AS-PCR反应较大的Mg2+等5个因素的浓度进行筛选，并对扩增反应程序进行优化，运用正交设计直观分析法和DPS 7.05统计软件对扩增结果进行方差分析。【结果】优化后的枇杷AS-PCR反应分析体系为： 25 μL反应体系中，含10×buffer2.5 μL，Mg2+浓度2.0 mmol·L-1，Taq酶1.5 U，引物0.5 μmol·L-1，模板DNA80ng，dNTPs0.4 mmol·L-1。反应程序为94 ℃预变性1 min；94 ℃变性30 s，退火温度30 s，72 ℃延伸1 min，35次循环；72℃延伸5 min，4 ℃保存。【结论】建立了基于S基因保守序列设计引物的枇杷AS-PCR反应体系，利用该体系成功确定了‘大五星’的S基因型为S2-S41，其中S41为新分离鉴定的枇杷S-RNase基因，它们在GenBank 上的登录号分别为JQ228451 和JX217035。 　　关键词： 枇杷； AS-PCR； 正交设计； 反应体系 　　中图分类号：S667.3 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪01-0062-07 　　配子体自交不亲和性（GSI）在蔷薇科果树中普遍存在，是阻止自体受精，预防近亲繁殖和保持遗传变异的一种重要机制，这种特异的识别反应在遗传上受S位点复等位基因控制[1]。这主要表现为自花授粉或相同S基因型的品种异花授粉时，花粉管在花柱上部停止生长，造成自花授粉或相同S基因型品种间授粉不结实[2]。长期以来在实际生产中常依据品种间相互授粉的坐果率来选择授粉树，这种方法虽然直观有效，但费时费力，同时由于不知道品种的S基因型，选择时又具有较大的盲目性[3]。因此鉴定自交不亲和的S基因型对生产栽培选择授粉品种具有重要的指导意义。随着分子生物学的快速发展，基于S基因保守序列设计引物的S基因特异PCR分析成为一种快速、简便、可靠的S基因鉴定方法，并在苹果、梨、甜樱桃等果树上得到了广泛的应用，但未见枇杷属植物AS-PCR反应体系系统优化的研究报道。为此我们建立并优化了枇杷属植物AS-PCR反应体系，为今后开展枇杷属植物S基因鉴定，加强资源利用和指导生产选择授粉品种奠定了基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　以栽植于四川农业大学园艺生物技术研究中心的‘大五星’、‘早钟6号’和‘龙泉5号’作为研究试材，采取未完全展开的幼嫩叶片提取基因组DNA。 　　1.2 基因组DNA提取 　　按照杨芩等[4]的方法提取基因组DNA，提取物用60 μL去离子水溶解，核酸蛋白仪（Eppendorf，BioPhotometer plus）测定DNA的浓度和纯度，并用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，-20 ℃保存。 　　1.3 引物来源 　　采用Ishimizu等[5]根据梨S-RNase 基因C1 区和C5 区下游保守序列设计简并引物： 上游引物： ‘FTQQYQ’： 5-TTTACGCAGCAATATCAG-3，和下游引物： ‘FI （D/N）CP（H/R）’： 5-GYGGGGGCARTYTATGAA-3，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 　　1.4 PCR扩增和优化设计 　　采用L25（56）正交表，参照甜樱桃[6]和苹果[7]的AS-PCR优化反应体系对影响反应较大的Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物、模板DNA浓度进行五因素五水平正交实验设计，各因素水平见表1，以空白项为误差项进行方差分析。 　　按表2编号加样，除表中所列因素外，还包括2.5 μL10×buffer，加去离子水补足25 μL。以‘大五星’DNA为模板对以上各因素进行优化，反应程序在参照甜樱桃[6]、苹果[7]AS-PCR反应程序的基础上，初步确定为94 ℃预变性1 min；94 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃再延伸5 min，4 ℃保存。 　　根据正交试验结果，选择合适的反应体系，对引物的最佳退火温度进行筛选。根据引物Tm值，设定退火温度（48～62 ℃），PCR仪（Bio-Rad公司PTC-200）自动生成12个温度梯度： 48 ℃、48.4 ℃、49.2℃、50.3 ℃、51.9 ℃、54 ℃、56.3 ℃、58.3 ℃、59.9 ℃、60.9 ℃、61.7 ℃、62.0 ℃。同时对循环次数、退火时间、延伸时间等影响AS-PCR反应的重要因素进行优化。 　　1.5 电泳结果评分及差异分析 　　参照