猪波形蛋白对PRRSV感染Marc—145细胞抑制作用.docVIP

猪波形蛋白对PRRSV感染Marc—145细胞抑制作用 　　摘 要：为了研究波形蛋白在介导猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染细胞过程中的作用，利用RT-PCR方法从PRRSV非易感细胞系猪肾细胞系PK-15细胞中扩增目的基因，克隆入pET-28a（+）载体，转化大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达。表达的重组猪波形蛋白经SDS和Western blot鉴定和纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用病毒抑制试验检测重组猪波形蛋白及多克隆抗体在PRRSV感染Marc-145细胞过程中的作用。结果表明，成功扩增猪波形蛋白基因并克隆入pET-28a载体，经诱导后得到高效表达，纯化后免疫兔子产生高价血清抗体（105）。病毒阻断结果表明，猪波形蛋白及多克隆抗体均能阻断PRRSV感染Marc-145细胞。 这为以波形蛋白为基础的PRRSV 受体阻断抑制剂的研究提供了实验依据。 　　关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；波形蛋白；病毒抑制；受体阻断 　　中图分类号：Q939.91 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2012）10-0001-07 　　猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV）能引起猪繁殖与呼吸综合征（ PRRS），俗称猪蓝耳病。临床表现为母猪晚期流产、早产、死胎和木乃伊胎等繁殖障碍和各年龄猪群的呼吸道症状。该病于1996年在我国首次报道[1]，给我国的养猪业带来了巨大的经济损失。 　　波形蛋白广泛存在于间充质细胞及中胚层来源的细胞中，主要与维持细胞及细胞器形态、参与有丝分裂和细胞分化、促进细胞粘附和移行、创伤愈合、信号传导、移植免疫和细胞凋亡等有关[2～4]。波形蛋白除了稳定细胞结构之外，还与其他的细胞骨架纤维一起参与许多病毒的侵入或感染过程，例如Ⅰ型疱疹病毒[5]、蓝舌病毒[6]、非洲猪高热病毒[7]、人的呼吸道合胞病毒[8]、痘病毒[9]、泰勒氏小鼠脑脊髓炎病毒[10]和日本脑炎病毒[11，12]等。 　　PRRSV通过细胞表面受体介导的内吞作用感染易感细胞，从而在细胞内完成其复制和包装等过程，该过程涉及多种蛋白，波形蛋白为其中一种。2006年Kim等用North-Western blot方法从Marc-145细胞中检测到与PRRSV 3′非翻译区RNA结合的分子量为57 ku的蛋白[13]，并验证该蛋白为波形蛋白。尽管波形蛋白在进化过程中是保守的，但在不同细胞内其执行的功能不同，在多种病毒感染过程中都有着重要作用。王伟伟等[14]研究证明PRRSV易感细胞系Marc-145来源的猴波形蛋白及其抗体能阻断PRRSV感染Marc-145细胞。目前已知猪是PRRSV唯一自然宿主，而猪肾细胞系PK-15细胞却是PRRSV的非易感细胞。为了进一步研究猪波形蛋白和猴波形蛋白的功能关系及其与PRRSV的关系，本研究从猪肾细胞系PK-15中扩增出波形蛋白基因，表达纯化后制备抗体，检测猪波形蛋白及其抗体对PRRSV感染Marc-145细胞的影响，为PRRSV致病机制及其受体阻断抑制剂的研究奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 病毒、细胞与菌株 　　PRRSV分离株TA-12（GenBank登陆号：HQ416720）、PK-15细胞、pET-28a （+）表达载体、受体菌E.coli Top10、表达菌BL21（DE3）均由本实验室保存，载体pMD18-T购自TaKaRa公司。 　　1.2 主要试剂 　　TRIZOL购自Invitrogen公司，HiFi ploymerase、dNTP、Ni-NTA Resin、DNA纯化试剂盒、质粒提取试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司，T4连接酶、限制性内切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ购自TaKaRa公司，异丙基-β-D-硫化半乳糖苷 （IPTG） 购自Promega公司，HRP标记的羊抗鼠IgG购自Jackson公司，His 单克隆抗体购自南京金斯瑞公司，抗PRRSV N蛋白单克隆抗体6D10由本实验室制备保存。 　　1.3 目的基因的扩增和序列的测定 　　根据GenBank上公布的牛波形蛋白序列（序列号NM_173969.3），设计并合成一对引物，上游引物5′-CAGCCATGTCCACCAGG-3′，下游引物5′-GCTGGTAGTATTTTGCTGC-3′。提取PK-15细胞总RNA，反转录合成cDNA，以其为模板进行PCR扩增。PCR反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 45 s，72℃ 90 s，30个循环；72℃ 10 min。PCR 产物经胶回收纯化后连接于pMD18-T载体，转化至感受态细胞Top10中，提取质粒