TOLL样受体在疟疾感染小鼠模型中表达量变化规律研究.docVIP

TOLL样受体在疟疾感染小鼠模型中表达量变化规律研究 　　摘要：为了深入了解疟疾病理过程中TOLL样受体（TLR）和炎症反应的关系，通过Real-time PCR、ELISA等方法，测定了小鼠感染伯氏疟原虫后其TOLL样受体（Toll like receptor，TLR）的mRNA水平和下游炎症因子的血清水平。结果表明，TLR-2、TLR-9、TLR-11的mRNA水平均显著升高，分别为对照的3.0倍、3.5倍和6.0倍。说明宿主通过TLR感知疟原虫的侵入，并启动下游炎症因子的过表达。 　　关键词：TOLL样受体；Real-time PCR；疟疾；小鼠 　　中图分类号：R382.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）15-3589-04 　　疟疾是一种以雌性按蚊为传播媒介的传染性疾病，主要流行在热带及亚热带地区。在全世界范围内，疟疾每年造成至少150万人的死亡并为许多发展中国家带来沉重的经济负担[1]。在中国北纬25°以南地区，仍有间日疟和恶性疟的流行。中缅及中越边境时有恶性疟原虫的输入病例，并且每年都有因疟疾感染而导致的死亡[2]。近年来，随着氯喹等一线抗疟药物的普遍使用，抗药性疟原虫在非洲及东南亚地区日益普遍，以青蒿素为基础的联合化疗成为治疗疟疾的首选[3]。但是，近年来在非洲已经出现了青蒿素抗性疟原虫，在亚洲的泰国等地甚至出现了青蒿素和氯喹双重抗性的疟原虫[3]。人类在青蒿素之后已经没有任何新的治疗药物或者手段来对抗疟疾了。所以开发新的抗疟药物或治疗方法已成为对抗疟疾的迫切任务。TOLL样受体（Toll-like receptor，TLR）是由Lemaitre等[4]于1996年首次发现。在随后的研究中发现TOLL样受体是机体天然免疫中非常重要的组成部分，在入侵病原突破了机体的机械屏障（如皮肤、黏膜等）后感知入侵病原并随后启动下游的炎症反应。研究表明，TOLL样受体可以感知细菌、真菌、原虫等病原微生物的入侵[5]。2005年，Science杂志报道，小鼠的TLR-11可识别弓形虫的肌动蛋白抑制蛋白样蛋白[6]。而在疟疾感染的进程中，TOLL样受体如何发挥作用尚无明确报道。本研究通过Real-time PCR等方法验证TOLL样受体在疟疾感染小鼠模型的病理进程中其表达量的变化，以探讨TOLL样受体在这一过程中发挥的作用。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物模型的构建 　　1.1.1 试验动物 4??6周龄昆明鼠90只，雌雄各半，体重18～22 g，购自新乡医学院动物中心。原生动物门伯氏疟原虫（Plasmodium berghei），购自北京大学医学院寄生虫学教研室。 　　1.1.2 感染小鼠 初次感染时，取10只小鼠，然后从液氮中取出冻存的伯氏疟原虫（其存在于购得的感染伯氏疟原虫的小鼠外周血中），37 ℃解冻复苏，将血液给每只小鼠腹腔注射0.3 mL。待小鼠外周血被虫体感染的红细胞超过30%后，摘除小鼠眼球取血，并加肝素抗凝。2 500 r/min离心20 min，弃上清液，加入灭菌生理盐水，重新悬浮红细胞，并重复上述步骤，如此反复洗3次后，加入灭菌生理盐水并悬浮红细胞，用于再次感染试验用小鼠。 　　1.2 肝脏的提取及保存 　　将感染小鼠麻醉后从眼球或心脏放血，放血后将其断颈，打开其腹腔，取出肝脏用液氮速冻并在液氮中保存。 　　1.3 血清的提取及保存 　　将小鼠麻醉后，打开小鼠胸腔，用无菌注射器从小鼠心脏直接抽取心脏血液后加入到灭菌EP管中，37 ℃ 2 h，2 500 r/min离心20 min，取上清液，液氮保存。 　　1.4 总RNA的提取 　　1.4.1 小鼠处理方法 取40只小鼠随机平均分为2组，即感染组和对照组，在感染组小鼠经腹腔注射感染伯氏疟原虫后，于1、24、96、144 h分别在2组各取5只小鼠麻醉，取心脏血后将其断颈取其肝脏。取出的血液加入到灭菌EP管中，37 ℃ 2 h， 　　2 500 r/min离心20 min，取上清液，液氮保存；肝脏用液氮速冻并在液氮中保存。 　　1.4.2 操作步骤 将试验要使用的枪头、EP管等用DEPC水浸泡至少14 h并高压灭菌，研钵180 ℃干热灭菌4 h。取小鼠肝脏（不超过20 mg）在液氮中研磨成细粉状，加入到裂解液中充分涡旋振荡，之后的步骤按天根试剂公司的动物组织总RNA提取试剂盒说明书进行。提取完成之后再在液氮中冻存。 　　1.5 反转录PCR过程 　　1.5.1 反转录反应 　　1）在微量离心管中加入总RNA 1 μL，Oligo dT 1 μL，轻轻混匀。 　　2）70 ℃加热5 min，立即将微量离心管插到冰上；然后再加入5×M-MLV Buffer（含dTT） 4 μL，dNTP 1