病毒载量检测及耐药分析课件.pptVIP

HIV病毒载量检测 1987年John首次提出病毒载量（viral load）的概念，指出它代表的是病毒的负荷，即在感染者体内复制的病毒的数量。实际上，体内复制的病毒数量是不能直接测量的，一般用血浆中HIV RNA的拷贝数代表HIV的病毒载量。 预测疾病进程 HIV疾病进程与病毒载量的关系十分密切，观察感染者病毒载量水平可大致预测其发病的可能。如右图所示。 病毒载量检测的意义 急性感染辅助诊断 在HIV急性感染抗体窗口期，抗原峰出现前后通常出现一个病毒载量的高峰,此时检测病毒载量，对于早期诊断HIV感染具有特殊的意义。 婴幼儿HIV感染早期诊断 宫内感染（检测定义）： 新生儿出生48小时内，进行病毒载量检测，如果检测到病毒核酸，则提示孕期（宫内）感染。 对18月龄以下幼儿的早期诊断：目前以2次核酸检测结果作为辅助诊断的依据。2次不同时间的样本核酸检测如果均为阳性提示为HIV感染，均为阴性提示未感染。同时到18个月时做抗体检测，抗体确证阳性方可诊断 HIV感染。 病毒载量检测的意义 感染HIV后，并非在任何情况下感染者都应该进行抗病毒治疗，这一方面是经济上的原因，更重要的是在于抗病毒药物的副作用和长期疗效。通常在病毒载量达到一定水平后（如35000-50000拷贝/毫升）才开始治疗。 通过治疗后检测病毒载量水平来确定治疗是否有效。患者接受治疗后，通常血浆中病毒载量水平应在4周内下降1个log以上,在治疗后的3~6个月,病毒载量应达到检测不到的水平。否则认为治疗效果不佳，甚至治疗失败。 样品的采集和处理 用于HIV病毒载量检测的样品可以为血清、血浆、组织和其他分泌物，有时还包括生物制品。 采集样品应避免微生物和核酸污染。避免RNA酶造成的降解，采样后4-8小时内处理。处理后的样品应分装、标记，冻存于-20℃以下，RNA类样品需要冻存于-80℃。 标本运送应在低温条件下进行。特殊情况下，可以用特快专递形式投寄，但必须将盛样品的试管包扎好，保证不会破碎和溢漏。 病毒载量检测方法 ? 逆转录PCR系统 Amplicor HIV-1 Monitor（RT-PCR, Roche） ? NASBA核酸序列扩增系统(NucliSens EasyQ, Biomérieux) ?分枝DNA信号放大系统 HIV-1 Quantiplex ( bDNA , Bayer) HIV-1RNA提取、纯化 PCR扩增1.变性（94℃） PCR扩增2.退火,引物配对（55 ℃）  PCR扩增3.延伸（72 ℃ ）Taq DNA 聚合酶促进引物的延伸 完成一次PCR复制过程 PCR扩增结果 扩增后检测2.显色 NucliSens EasyQ 基本原理 病毒裂解，核酸提取、纯化 NASBA: 扩增阶段 扩增后实时检测技术 扩增后实时检测技术 EasyQ Graphs结果图 bDNA技术的特点 不需要RNA提取、纯化及PCR扩增，避免了提取和扩增核酸可能产生的污染问题。 没有PCR反应，不受抑制Taq DNA聚合酶因素（例如肝素）的影响. 精确度好,结果数据稳定可靠。 能够与HIV-1 M群的A—G亚型结合。 可批量处理样品，最多168个。 实验环境要求不高(one room technology)。 方法操作简便,无需特殊耗材,操作人员易于掌握。 病毒载量检测结果的分析和解释 目前用于统一不同定量方法检测值的标准品尚未问世，不同定量方法结果之间还无法直接进行比较，建议同一病人治疗前后用同一方法进行HIV定量检测。 分析一个病人不同时间病毒载量测定的结果时，首先要考虑测定结果的变化是真实的生物学改变还是方法本身的变异或误差。病毒载量的变化超过0.5log（大约是3倍）就超过了实验和每日的正常变化，应被视为有生物学意义的变化。特别需要注意的是在接近检测下限的时候，实验的变异对于解释病毒载量变化的意义有更大的影响。 病毒载量检测结果的分析和解释 核酸检测的显著优点是高度敏感性，因此增加了污染和取样误差的危险。作为HIV感染的辅助指标，核酸检测不能完全确定是否感染，但是当载量测定出现较高拷贝数的阳性结果时（1000）提示感染发生的可能性非常大。这时，应综合其他检测数据和样品背景情况进行综合分析判断。 对于低于最低检测限的样品，也不能排除HIV感染。 做好质量控制 样本 检测 报告 做好质量控制 样本 样本类型：血浆和血清标本都可用来测定病毒载量，用三种测定方法进行比较发现血清和血浆测定的结果有高度相关性。 抗凝剂：抗凝剂能够显著影响测定的结果。肝素钠处理的血浆不适合做Amplicor HIV-1 Monitor 。不同时抗凝剂对RNA降解的速度也是不