油菜秸秆纤维素降解菌筛选及复合菌剂降解特性.docVIP

油菜秸秆纤维素降解菌筛选及复合菌剂降解特性 　　摘要：从土壤、腐烂的木桩和成品肥料中筛选高效降解油菜秸秆纤维素的菌株，并通过正交试验对菌种进行复配组合，筛选出一组高效降解油菜秸秆的复合菌剂，其羧甲基纤维素（CMC）酶活性为12 704.3 U/g，滤纸（FP）酶活性为1 227.7 U/g，秸秆失重率为25.65%，初步鉴定该菌剂组成为地衣芽孢杆菌B4、链霉菌A8、米根霉M3和木霉X1。采用此复合菌剂以油菜秸秆粉为降解原料进行14 d的发酵，纤维素降解率为33.10%，半纤维素降解率为23.70%，相比于不加菌剂的对照组，自制菌剂的纤维素、半纤维素降解率分别提高了24.50%和15.60%。 　　关键词：油菜秸秆；纤维素降解菌；复合菌系；降解特性 　　中图分类号：Q93-331；TQ920.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）10-2264-04 　　中国油菜种植面积和产量常年居于世界首位，2009年油菜播种面积为700×104 hm2[1]，如此巨大的油菜种植面积，在菜子收获后必将产生大量的废弃油菜秸秆。据测定，油菜秸秆中含有丰富的氮、磷、钾及有机质等营养成分，然而，目前油菜秸秆并没有得到合理的利用，大量的秸秆被直接焚烧，这不仅污染了环境，同时造成了资源和能源的极大浪费[2，3]。因此，如何有效地开发利用油菜秸秆，发挥其潜在资源价值，成为当前亟待解决的问题。 　　油菜秸秆的主要成分是木质纤维素类物质，木质素含量为16%～21%，纤维素为38%～42%[4]，木质纤维素的高含量是阻碍其资源化利用的关键。提高富含纤维素的工农业废弃物的利用率，已成为近年来研究的热点[5]，目前对纤维素类物质的有效利用主要采取生物法，利用微生物手段使其达到资源化处理和利用[6]。而且油菜秸秆细胞壁的结晶度较高，木质素与纤维素之间镶嵌形成稳定结构，导致其应用远远不如其他主要粮食作物秸秆，针对油菜秸秆的微生物处理在国内外鲜有报道[7]。为此，以降解油菜秸秆纤维素为目的，通过从土壤、腐烂的木桩和成品肥料中筛选油菜秸秆纤维素的高效降解菌株，并对菌种的复配组合以及降解特性进行研究。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 仪器 智能人工气候箱，电热恒温水浴锅，恒温干燥箱，722型可见分光光度计???电热恒温隔水式培养箱等。 　　1.1.2 样品 　　1）华中农业大学校内油菜种植地收集油菜秸秆及离地面深约15～20 cm处的潮湿土壤；校门口一棵腐烂的木桩上取朽木样。样品自然风干后磨碎，过20目筛，装入塑料封口袋，至4 ℃冰箱中保存。 　　2）市售某品牌秸秆腐熟剂。 　　1.1.3 培养基 LB培养基；马铃薯蔗糖培养基；高氏一号合成培养基；刚果红纤维素琼脂培养基；固体产酶发酵培养基：油菜秸秆粉10 g，无机营养液25 mL，料水比1∶2.5，pH自然，分装于250 mL三角瓶中。无机营养液：（NH4）2SO4 1%，KH2PO4 0.05%，MgSO4·7H2O 0.025%。 　　1.2 方法 　　1.2.1 油菜秸秆纤维素降解菌的筛选 称取10.0 g样品，加入装有90.0 mL无菌水以及玻璃珠的250 mL三角瓶中，在摇床上180 r/min 振荡30 min，使样品完全分散后取出，进行系列梯度稀释，取稀释液涂布在刚果红纤维素粉鉴别培养基中，30 ℃恒温培养3～4 d，选择周围有透明水解圈的菌株进行划线分离，直到得到单菌落。将纯化后的菌株以点种的方式接种于刚果红纤维素平板培养基上，30 ℃恒温培养3～4 d，每天测定纤维素降解圈直径（H）和菌落直径（C），并根据降解圈直径与菌落直径之比H/C的大小确定初筛菌株。 　　采用DNS法[8]测定CMC酶活性和FP酶活性，将初筛菌株接种于以油菜秸秆粉为惟一碳源的固体培养基中，发酵产酶4 d后提取粗酶液，通过酶活性比较，最终筛选出油菜秸秆纤维素降解菌株。 　　纤维素酶活性定义：参照国际酶学委员会规定的国际单位IU，将酶活性单位定义为：在特定条件（pH 4.8、50 ℃）下，1 mL酶液每分钟催化底物生成1 μg葡萄糖所需要的酶量。10 g发酵曲溶于100 mL的提取液中，则： 　　E=（W×N×1 000）/（t×0.1V） 　　式中，E为酶活性，单位U/g ，W为葡萄糖量， N为酶液稀释总倍数，t为反应时间，V为酶液体积。 　　1.2.2 菌株复配组合筛选 　　1）菌株拮抗试验。对最终筛选出的19株纤维素降解菌作拮抗试验。方法如下：细菌-细菌、细菌-放线菌、放线菌-放线菌，将两种不同的菌株在LB平板上划线但不相交；霉菌-细菌、霉菌-放线菌，先用接种针挑取少量霉菌菌丝或孢子，点种于PDA平板中央，恒温培养1～2 d，待霉菌直径约5 cm时