SSR聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和银染检测技术实验报告.docx

实验报告一、实验目的和要求了解SSR标记的检测方法；了解PAGE银染检测SSR的原理；掌握PAGE银染检测SSR的技术。二、实验内容和原理1. 根据DNA大小及类型的不同，可通过电泳进行分离。聚丙烯酰胺凝胶电泳适合分离1kb以下的片段，最高分辨率可达1bp，适宜于微卫星等位基因间的差别检测。 2. 银染方法的建立始于1979 年对蛋白质的染色，以后逐渐应用于核酸。3. 银染原理：扩增DNA经电泳分离后，Ag+可与之形成稳定的复合物，在甲醛的作用下被还原成银颗粒，呈现棕褐色谱带。三、实验仪器与材料实验材料：已准备的12个水稻材料的PCR产物。实验耗材：PCR管、枪头（tip）、1次性塑料手套等；仪器设备：PCR仪、电泳仪、垂直电泳槽及制胶装置、凝胶成像系统/扫描仪、移液枪、塑料托盘等。试剂及配制：引物（10mM）：根据含有SSR的序列设计而合成的，用无菌双蒸水配制所需浓度。dNTP溶液（2mM）：将采购的溶液分装，直接稀释到所需浓度即可。Taq DNA聚合酶（5U/μl）：直接采购。10 x PCR缓冲液：直接采购。DNA分子量标准：直接采购。0.5mol/LEDTA ： 在800ml水中加入186.1g EDTA-Na.2H2O，搅拌并用氢氧化钠调PH至8.0，定溶至1L，分装后高压灭菌备用。TBE电泳缓冲液（Tris-硼酸5×贮存液）：Tris 碱54g/L和硼酸27.5g/L溶于蒸馏水，加入20ml (pH8.0) 0.5mmol/L EDTA，定溶到1L。用时稀释5倍。上样液（6×）：溴酚兰0.25%、二甲苯青0.25%、蔗糖40%的混合液。封胶液：1g琼脂糖放于100ml TBE煮沸溶解、混匀。30%丙烯酰胺（100 ml）：将丙烯酰胺29克和N、N-亚甲叉双丙烯酰胺1克用蒸馏水溶解，定容至100 ml。或从公司直接采购的40%（Acr:Bis=29：1）溶液。实验材料说明：SSR标记：共6个，每组1个模板12个：C101、谷梅2号、谷梅4号、 IR24、 IR64、 富锦、CK122、株6S、 R2106、 316S、 R248、日本晴PCR：反应总体积为15μl ，包括7.5μl的2×Taq Master Mix(含dNTP)，1μl的模板DNA(50-100ng)，10μM的上下游引物各0.5ul，用去离子水补足至15μl ；94℃ 5min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，共35个循环；72℃延伸8min，4℃下保存。样品：每组领取12个PCR样品，记录组号和点样位置。四、操作方法和实验步骤组装玻板与封胶：将玻璃板与胶皮套组放在一起，并用封胶液(1%琼脂糖)将底步空隙封闭，制成铸胶槽。 制胶：配制40ml的 8%胶液。先加水，最后加TEMED 和10%过硫酸铵，混匀后立即注入铸胶槽中，并插入梳子，静止聚合40分钟以上。在灌胶时注意不要产生气泡。上样：凝胶完全聚合后拔出梳子，用电泳缓冲液冲洗梳2-3次，然后在上下槽中加满电泳缓冲液后即可点样电泳。在含扩增产物的反应管中按1:5加入上样缓冲液混匀（已做），取0.8μL轻轻加到梳孔中。电泳：点样完毕后，恒压 120V（可根据时间适当调整）电泳至溴芬兰至胶板底部（2h）。剥胶与固定：小心剥下凝胶，去离子水漂洗，然后加入固定液，轻摇固定10-15分钟。（固定步骤可省略） 染色：倒去固定液，去离子水中漂洗，加入染色液，轻摇染色10分钟。显色：去离子水洗2次，加入显色液，轻摇显色；观察条带的出现情况，当条带显示清晰后，立即加入10%乙酸终止，然后加水冲洗。记录结果：拍照或记录结果，实验报告中写明SSR标记（组号）、材料名称，计数扩增带数（表格），计算材料间的遗传相似系数和所用标记的多态信息含量等，并对结果及相关问题进行讨论。五、实验数据记录和处理1、电泳结果记录：使用3号RM3867的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离与银染检测结果如下图1：图1 使用3号RM3867的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离结果，将各泳道从左到右编号为1-12，对应模板分别为C101、谷梅2号、谷梅4号、IR24、IR64、富锦、CK122、株6S、R2106、316S、R248、日本晴根据上图1，除去无法识别的12号材料电泳结果，与已有的结果图对比，可确定我们组使用的是RM3867。记录RM3867在12个材料中的扩增情况，如下表1：表1 RMX在12个材料中的扩增情况材料C101谷梅2号谷梅4号IR24IR64富锦CK122株6SR2106316SR248日本晴条带数33333343333　2、计算材料间的遗传相似系数和所用标记的多态信息含量根据图1 及遗传相似系数(GS)公式GS=2Nij/(Ni+Nj) 计算，12个材料之间遗传相似系数结果如下表2（Nij为材料i和j共有的扩增片段数目，