广谱病毒趋化因子受体拮抗性多肽的设计筛选及作用机制初步研究（可编辑）.docVIP

广谱病毒趋化因子受体拮抗性多肽的设计筛选及作用机制初步研究 库,作为筛选平台,运用噬菌体展示技术淘选与多肽 H22 结合的亲和序列; Fmoc- 固相法合成经过修饰的克隆序列多肽 H9;采用磷酸钙转染技术,以 HCMV病毒 液上清为模板扩增 US28 基因,构建稳定表达 HCMV US28 基因的 NIH/3T3 细 胞系,作为拮抗剂的药效学研究平台;然后 ELISA 实验来验证抑制剂多肽 H9 与受体的结合,通过流式细胞仪测定钙离子浓度变化来判断多肽 H9 对受体引起 的细胞内信号转到的阻断,昀后利用抗病毒实验来证实多肽 H9 对病毒的拮抗作 用效果。 结 果 趋化实验显示,US28 胞外段模拟分子多肽 H22 不激发细胞定向 趋化却可抑制由 CC类和 CX3C类人趋化因子引起的定向迁移,构建肽库成功表 达,可筛选到 24个阳性克隆,选取其中 12个测序,得到 8种序列,其中 8个克 隆都表达 LNAHCAL 保守序列,稳定性较好的序列 H9 为 VLNAHCALH;通过 pcDNA3.1 真核表达载体成功构建稳定表达 US28 的 NIH/3T3细胞系,受体配体 ELISA 结合实验显示,多肽 H9 可与细胞膜上 US28 受体良好结合,细胞内功能 性实验显示多肽 H9可以下调由生理性趋化因子与受体结合引起的钙离子浓度升 高,其本身并未引起钙离子浓度变化,抗病毒功能实验显示多肽 H9能抑制 HCMV AD169 诱导的噬菌斑形成,减少病毒感染细胞的病变和抑制病毒在细胞内的复 制,对抑制 HCMV AD169感染产生的包涵体的 EC 0.46ng/ml,抑制 pp65抗原 50 产生作用的 EC 0.34ng/ml。 50结 论 US28 胞外段模拟分子多肽 H22 具有体外计量型阻断细胞趋化活 动的活性;通过构建的趋化因子肽库可筛选到克隆序列 LNAHCAL,筛选方法切 实可行;阳性克隆抑制性多肽 H9 能够模拟细胞外生理性趋化因子与 US28结合, 具有阻断受体信号转导的效应,并具有抗 HCMV AD169 活性,可抑制病毒进入 细胞和胞内复制,提示多肽 H9 能够作为广谱编码病毒同种型趋化因子受体的拮 I 抗剂,为研究相关病毒防治的相关工作奠定基础。本研究首次在病毒拮抗类药物 的筛选中成功引入“诱获受体配体”系统,将为以后的研究提供新的策略和引导 新的方向。 关键词 人类巨细胞病毒 ;US28 ;磷酸钙转染 ;信号转导 ;拮抗剂II Abstract Objective based on US28’s unique combination of broad-spectrum chemokine receptor and herpes-like virus feature ecognition, in this study, we used affinity selection, biological activity research and anti-virus pharmacodynamics tools to get positive clones and to clarify the mechanism and effect, in order to get the chemokines receptor binding antagonists if of human cytomegalovirus treatment, and provide new drugs with broad-spectrum anti-viral drugs featuresMethod Using TRANSWELL chemotaxis and chemotactic suppression experiment to test target molecules H22’s activity; selecting 25 chemokine to construct a chemokine expressioning peptide libraries as a screening platform; using phage display panning to select H22 binding affinity sequence; Fmoc-solid phase synthesis of modified cloned sequence; using calcium phosphate transfection techniques infect the virus supernatant HCMV US28 amplified gene