蜂胶中掺杂物的鉴别——高效液相色谱指纹图谱法标编制说明.doc

《蜂胶中掺杂物的鉴别——高效液相色谱指纹图谱法》行业标准 编制说明 (征求意见稿) 本标准制定任务来源 依据中华全国供销合作总社办公厅文件《关于下达2011年度第二批供销合作行业标准制修订项目计划的通知》，文件编号：供销厅科字 [2011]45号，本标准列入了2011年度供销合作行业标准制修订计划，项目计划编号2011GH-2-002。该标准由牵头起草，中华全国供销合作总社归口管理ZL200510060230.8。2009年牵头起草单位采集了我国不同地区56个蜂胶原料，建立了较全的蜂胶指纹图谱库[14]，从指纹图谱上看，各区域蜂胶主要特征指纹色谱峰90%以上是相似的，这表明我国各地区蜂胶的主要胶源植物是相同的。 2010年周梦遥等报道：亚洲大陆地跨寒、温、热三个气候带，气候类型复杂，适合杨树属植物生长。中国、韩国、伊朗等地的蜂胶主要以杨树型为主。Ahn 等人采用色谱指纹图谱技术，系统研究了中国和韩国不同产地蜂胶的抗氧化酚类化合物，发现中国和韩国蜂胶的成分与欧洲蜂胶的化学成分极为相似，均属于杨树属蜂胶[15]。这一观点与我们得出的结论是一致的。 2010年沙那等对蜂胶的HPLC指纹图谱进行了研究，对18批不同产地蜂胶进行分析。采用相似度评价软件,通过相似度计算，结果各种产地蜂胶相似度在0.831-0.984，相似度大于0.90的有15批，占83%[16]。这一结论也与我们的是一致的。 以上表明本标准的技术原理是科学、可行的。 本标准方法的优选 采用中药指纹图谱技术来鉴别蜂胶真伪是本标准制定的出发点，中药指纹图谱的测定方法有多种，综合考虑操作简便性、仪器成本等方面因素，我们选用了高效液相色谱（HPLC）方法。而自然界的绝大多数化合物都有紫外或可见光谱吸收，蜂胶中的功效成分黄酮类化合物在紫外光区吸收明显。所以本标准的方法确定为：高效液相色谱紫外检测法。 5.1 指纹图谱检测方法的建立 5.1.1 样品处理方法优选： 蜂胶中的黄酮类化合物溶于甲醇，但是在水中微溶或者不溶，我们选择了10%、20%、40%、60%、80%等不同浓度的甲醇溶液提取蜂胶的黄酮类化合物，采用《保健食品检验与评价技术规范》（2003版） H3PO4混匀，沉淀杂质，甲醇与磷酸的比例与流动相一致，最后用流动相定容，确保前处理样液中的溶剂与流动相一致，这样，样液经过含有流动相的色谱柱时不会有物质析出，不会堵塞污染色谱柱，延长了柱子寿命。 样品取样量的确定，由于样品中蜂胶含量不一样，称取相同量的样品，最后的色谱峰面积会存在明显的差异，影响特征峰之间的比较和定性。故先对总黄酮进行定量测定后，确定有效成分的含量，再据此确定取样量，可以保证在同一浓度水平比较指纹图谱，使得定性更加准确。 优化后的样品前处理方法为：按照《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）HPLC 指纹图谱真伪鉴别研究中，分别采用依利特Hypersil C18 、艾杰尔Venusil MP C18、安捷伦Zorbax C18、迪马C18、思谱C18等色谱柱作为分离柱，结果发现Hypersil C18等色谱柱对蜂胶特征峰的分离效果不够理想。而采用Venusil MP C18作为分离柱，分离效果良好。鉴于不同色谱柱对各种成分分离行为差异较大，故本标准规定了色谱柱使用的规格和型号为：Venusil MP C18 4.6mm×250mm,5μm。各种色谱柱分离色谱图见图1。 图1.不同品牌色谱柱的分离色谱图 1.思谱 2. 依利特 3.安捷伦 4. 迪马 5. 艾杰尔 5.1.2.2流动相优选。 采用了不同比例的甲醇-0.4%H3PO4作为流动相，考虑60%甲醇提取样品时杂质较少，能够有效提取黄酮类化合物，故确定了甲醇：0.4%H3PO4 = 60:40的流动相比例。经过试验表明，可达到较好的分离效果，定位用的八种黄酮类化合物的分离度均大于1.5。 5.1.2.3检测波长优选。 由于具有2-苯基色原酮的基本结构，黄酮类化合物具有特定的紫外吸收峰，常有两个较强的吸收带，I带在300—400nm范围内，它是由于B环桂皮酰基引起的，Ⅱ带为240—285nm范围内，它是由于A环上的苯甲酰基引起的。根据目前现有检测黄酮类化合物的相关标准及文献，我们选择性地采用了254nm、276 nm、 280 nm、 360 nm、 415 nm等不同波长对样液进行测定，发现360nm波长下的色谱峰信息丰富、适中，蜂胶与杨树胶指纹特征差异明显，且各特征峰之间分离良好，符合中药指纹图谱对峰信息的基本要求，故选择360nm作为本标准的检测波长。 优化后的液相色谱条件如下： 色谱柱：Venusil MP C18 4.6mm×250mm,5μm或相当者； 流动相：甲醇：0.4%H3PO4 = 60:40 流速：1.0ml/min 检测波长：36