调控内胚层组织器官发的分子机制研究.docVIP

一、研究内容 在本项目拟开展的研究工作中，我们将应用斑马鱼、非洲爪蟾、小鼠等模式动物和胚胎干细胞研究体系，以肝脏和胰腺这两个重要的内胚层器官为主要研究对象，辅以肠道的研究，沿着从内胚层细胞到内胚层器官前体细胞的命运预定、到前体细胞的分化和成熟功能细胞的形成、到器官的形态建成、功能发挥、和受损再生的动态连续过程，全面深入地研究在内胚层组织器官特别是肝脏和胰腺的发育和再生过程中发挥重要功能的因子、信号途径和表观遗传稳定性的作用机制，并阐明其中可能存在的时间、空间网络关联。按照本项目拟设置的三个课题，具有研究内容如下： 课题一：调控肝脏和肠道发育的分子机理研究 斑马鱼体节形成早期预定的肝脏和肠道前体细胞在内胚层中的细胞谱系定位。1）可精确分选预定的肝脏前体细胞的转基因斑马鱼的建立；在预定的肝脏前体细胞中异表达基因筛选及其功能机制研究。）斑马鱼预定的肝脏前体细胞分选，者差异表达基因的芯片筛选研究。 肝脏发育基因筛选与功能研究。1）肝脏不同时期的差异表达基因的芯片筛选；2）差异表达基因的功能和作用机理研究。 利用胚胎干细胞体系研究肝前体及肝细胞体外分化的分子机理。1）胚胎干细胞向肝脏前体细胞分化过程中命运决定的分子机理；2）胚胎干细胞来源的肝脏前体细胞的基因表达特性分析，影响其定向分化的关键基因的寻找及作用机理研究；3）胚胎干细胞来源的肝脏前体细胞的体外分化能力及分子机理研究。 H3的N端三甲基化表观遗传调控机制肝细胞分化中的功能。1）肝干细胞的形成与分化中组蛋白H3三甲基化与染色质形成的关系；2）肝细胞特异的组蛋白H3三甲基化酶的克隆；3特异组蛋白H三甲基化酶在肝细胞形成与分化中的作用与分子机 表观遗传在内胚层器官发育的不同阶段的稳定性及其功能的系统研究。1）在内胚层器官发育的不同阶段H3K4Me3、H3K27Me3、H3K9/18Ac、H4K12Ac的系统研究；2）选取具有代表性的位点，研究染色质上相应位点在调控发育功能。具有缺陷的斑马鱼突变体及致变基因的功能机制具有发育缺陷突变体的表现型导致发育缺陷的致变基因。 NEMOIKK(的K63多泛素化在调控肝脏发育中的功能与分子机理。1）NEMOIKK(及其多泛素化在调控斑马鱼肝脏发育中的功能；2）NEMO/IKK(多泛素化酶的确定及其在肝脏发育中的功能。Wnt信号途径及其调控因子KLP在斑马鱼肝脏发育中的功能机制。1）Wnt信号途径调控肝脏发育的分子机理；）KLP调控肝的分子机理。在预定的前体细胞中异表达基因筛选及其功能机制研究。）斑马鱼内胚层细胞预定的前体细胞非预定前体细胞的分选，者差异表达基因的芯片筛选非洲爪蟾预定的胰腺内胚层细胞特异性调控因子的筛选和功能机制研究。1）非洲爪蟾囊胚晚期/原肠早期预定的胰腺内胚层细胞的细胞谱系分析定位；2）基因芯片比较正常的预定胰腺内胚层细胞与BMS453处理过的内胚层细胞、RA处理过的内胚层细胞、高表达了Hex的内胚层细胞、高表达了VegT和β-catenin的爪蟾胚胎多能性前体细胞的基因表达图谱以筛选出决定预定胰腺内胚层细胞的特异性内在调控因子；3）对筛选所得重要调控因子发挥功能的分子机理研究。非洲爪蟾胰腺特异性表达的新基因的筛选及功能机制研究。1）利用大规模整体原位杂交从非洲爪蟾胚胎及成体的胰腺cDNA文库中筛选胰腺特异性表达的新基因；2）新基因调控胰腺发育的功能及分子机理研究。Hex特异性地诱导腹侧胰腺前体细胞增多的分子机理研究。1）Hex在原肠胚期过量表达诱导巨大腹侧胰腺的细胞机制研究；2）Hex的相互作用因子、在染色质上附着位点、下游调控基因的筛选及其调控胰腺发育的分子机理研究。非洲爪蟾胚胎胰腺和肝脏的体外重建。1）在经过早期紫外线照射形成的爪蟾belly piece中选择性地恢复胰腺和肝脏形成的研究。2）在体外诱导爪蟾胚胎多能性前体细胞形成胰腺及真正成熟的胰岛β细胞的研究。利用胚胎干细胞体系研究胰腺细胞体外分化的分子机理。1）分别建立1和 3启动子驱动的报告体系；2）研究RA, BMP, FGF等信号途径调控1表达的分子机理；3）胰腺前体细胞的基因表达谱分析，胰腺前体细胞向内分泌细胞分化过程中的信号调控机制研究；4）胰内分泌前体细胞的基因表达谱分析，N3下游调控基因的表达谱分析具有胰腺缺陷的斑马鱼突变体及致变基因的功能机制具有胰腺发育缺陷突变体的表现型导致胰腺发育缺陷的致变基因。分离小鼠内胚层组织的成体干细胞，确定干细胞的分化途径以及分化的子代细胞。1利用三维培养体系，从小鼠胚胎和新生小鼠体内分离和富内胚层组织的干细胞前体细胞，确定其表面标记分析成体小鼠内的干细胞前体细胞组分分析干细胞前体细胞的基因表达模式，确定干细胞前细胞内特异基因表达建立体外干细胞前体细胞分化体系确定内胚层细胞分化谱建立体内细胞分化测定体系，确定体内分化谱，比较体内