分子生物学第六章 分子生物学基本研究法(下)-基因功能研究技术.ppt

第六章 分子生物学基本研究法（下）—基因功能研究技术 6. 3 蛋白质及RNA相互作用技术 6. 3. 1 酵母单杂交系统（Yeast one-hybrid system） 是上世纪90年代中发展起来的研究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术，可识别稳定结合于DNA上的蛋白质，在酵母细胞内研究真核生物中DNA-蛋白质之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。 将已知顺式作用元件构建到最基本启动子（minimal promoter，Pmin）的上游，把报告基因连接到Pmin下游。 将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（transcription-activating domain, AD） 融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活 Pmin启动子，使报告基因得到表达。 转录因子与顺式作用元件结合，激活最基本启动子Pmin，使报告基因表达。若接入3个以上顺式作用元件，可增强转录因子的识别和结合效率。 上游 下游 结构域 启动子 二者融合导入酵母细胞 * * 基因表达研究技术 基因敲除技术 蛋白质及RNA相互作用技术 基因芯片及数据分析 利用酵母鉴定靶基因功能 其他分子生物学技术 6.1 基因表达研究技术 6. 1. 1 基因表达系列分析技术（Serial Analysis of Gene Expression，SAGE） 以DNA序列测定为基础定量分析全基因组表达模式的技术。 任何长度超过9-10个碱基的核苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产物。因此，可用特定限制性核酸内切酶分离转录产物中具有基因特异性的9-10个碱基序列并制成标签。 将10-50个序列标签连接、克隆、测序后，根据其占总标签数的比例即可分析所对应编码基因的表达频率。 常规SAGE方法（short SAGE）基本流程 连接子1和连接子2的5ˊ端分别加有氨基，以防止5ˊ端相连接。 分离提取合成cDNA 用锚定酶AE消化 分3ˊ端酶切两份，分别与ⅡS类TE标签酶识别位点结合。 标签酶TE酶切 末端补平 连接两份，根据接头1、2设计引物进行PCR 得到双标签，分离纯化串联入载体。 连接10-50个标签进行克隆，测序，分析 LongSAGE技术 传统的SAGE技术用14个碱基的标签代表一个基因并不能覆盖人类基因组内所有的基因序列，因而又发展了LongSAGE技术。 LongSAGE标签来自转录物3’端一段21bp的序列，可以进行快速分析并与基因组序列数据相匹配。 其原理与传统的ShortSAGE方法类似，只是用了不同的ⅡS类标签酶（MmeI），并将程序做了相应修改。 6. 1. 2 RNA的选择性剪接技术 RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从一个mRNA前体中产生不同的mRNA剪接异构体的过程。可分为： 平衡剪切； 5’选择性剪切； 3’选择性剪切； 外显子遗漏型剪切及相互排斥性剪切。 常用RT-PCR法（反转录PCR）研究某个基因是否存在选择性剪切。 RT-PCR：把RNA提取后反转录成cDNA，并以其为模板进行的PCR反应。 平衡剪切 5’选择性剪切 3’选择性剪切 外显子遗漏型剪切 相互排斥性剪切 一般用RT-PCR法研究一个基因是否存在选择性剪接。选择性剪接使一个基因翻译为多种蛋白质序列。分析人类基因组数据发现60%的基因在表达中可通过选择性剪接产生各种形式的mRNA。 该基因编码一个神经无轴突定向受体，4号外显子有12个变异体，6号外显子有48个变异体，9号外显子有33个变异体，17号外显子有2个变异体。推测该基因共有12×48×33×2=38016剪接异构体。 6. 1. 3 原位杂交技术 原位杂交( In Situ Hybridization，ISH) 是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射 检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体 上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手 段，分为两大类： RNA原位杂交 染色体原位杂交 RNA原位杂交：一般用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定 的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，就可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基 因的表达产物做出定性定量分析。 用组织原位杂交技术检测棉花纤维特异基因的表达 荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH) 首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记， 然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。 6. 1. 4 基因定点突变(site-directed mutagenesis) 该方法通过改