分子生物学技术在医学研究中的应用 基因表达.ppt

* * 分子生物学技术 在医学研究中的应用 （基因表达） 基因表达 ?基因表达指基因组中某基因在细胞中 转录为mRNA和翻译成蛋白质的过程。 ?基因表达的改变预示着细胞在分子水平 上的变化。它往往是细胞形态功能变化之 前的变化。 DNA RNA Protein 转录 翻译 影响基因表达的因素： 1、遗传因素 个体差异，终生不变。 2、环境因素 激素、药物，细胞因子、机械刺激、 病原体感染、电刺激、细胞转化….. 研究基因表达的手段 1、RT-PCR (RNA) 2、Northern blot (RNA) 3、Western blot (蛋白质） 4、免疫组化 （蛋白质） 原位杂交、点杂交、RNA酶保护试验 基因芯片 1、RT-PCR 基本原理： 将细胞中mRNA逆转录为cDNA，以cDNA 为模板，进行PCR反应。根据PCR产物的 量，判断基因表达的强度。 mRNA cDNA PCR产物 RT-PCR是一种半定量方法 实验操作： 1）RNA提取：Trizol 试剂盒。 防止RNA降解 RNA提取的成功与否 是RT-PCR检测中最 重要的步骤。 2)逆转录： RNA、缓冲液、dNTP、逆转录酶、 引物（随机引物，Oligo dT) 5’ AAAAAAAA3’ TTTTTTTT mRNA cDNA 3) PCR 特异性引物、模板、Taq 聚合酶。 通过PCR，将目的片段扩增几十—百万倍。 在一定范围内和一定的条件下，PCR的产物量 与模板量呈正比关系。 循环次数 产物量 模板量 4）几个注意问题： 反应平台 内参 1、PCR效率差异，重复性 2、内参选定 3、共同扩增 4、扩增片段长度 5、mRNA丰度，目标片段与内参片段 iNOS (诱导型一氧化氮合酶) GAPDH (磷酸甘油醛脱氢酶) 5) PCR产物量的测定 应用图象分析软件进行密度测定。 目标带密度-背景密度 内参带密度-背景密度 = 相对量 处理后样品相对量 处理前样品相对量 = 变化率 100% 160% A B C D 2.0 2.0 2.0 1.0 2.0 2.0 1.0 1.0 RT-PCR特点： 优点： 灵敏度高、特异性高、操作简便。 缺点： 可靠性差、不能细胞定位。 2、Northern blot 标记探针与膜固相RNA杂交。 根据杂交信号强弱判断表达量， 根据杂交信号位置判断分子长度。 杂交信号 实验操作： 1）RNA提取 2）RNA电泳（分离不同长度RNA) 3）转膜 (形成固相RNA) 4）探针标记（同位素/非同位素） 5）预杂交，杂交 6）洗膜 7）显影（放射性/酶促） Northern blot 特点： 因为没有扩增过程，Northern blot 的结果可靠性高。 可以确定未知基因的转录产物（mRNA）长度。 优点： 缺点： 1、操作烦琐 2、同位素 3、灵敏度低 4、对RNA质量要求高 5、不能定位细胞 3、Western blot 标记抗体与膜固相蛋白作用。 根据信号强弱判断蛋白表达强度。 根据信号位置判断蛋白分子量。 标准分子量 蛋白 特异性反应带 1）蛋白提取 2）蛋白电泳（分离不同分子量蛋白） 3）转移 4）封闭 5）一抗作用 6）标记二抗（HRP/AP标记）作用 7）显色 实验操作： *