2011.6 平板划线及生化实验.pptVIP

平板划线及生化实验室 沈源庆 内容提要 常规检测中需要平板划线的条款 平板划线、转接、革兰氏染色图示 大肠杆菌、沙门氏菌生化实验 溶血环的概念，菌种传代，抑菌实验 API 20E实验项目，抗原筛选的原理。 日常检测项目中涉及平板划线的条款 GB/T4789.38-2008,6.4：伊红美蓝平板分离培养，检验平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。6.5：营养琼脂斜面或平板培养：从每个EMB平板上挑取5个典型菌落。用接种针触菌落中心部位，移种到NA斜面或平板上，36℃±1℃，18h~24h培养。 GB/T 4789.4-2010，5.3 分离：分别用接种环取增菌液1 环，划线接种于一个BS 琼脂平板和一个XLD 琼脂平板（或HE 琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）5.4.1 自选择性琼脂平板上分别挑取2 个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板。 GB 4789.10—2010 ，5.2.2 将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker 平板和血平板， 日常检测项目中涉及平板划线的条款 GB 4789.30—2010，5.2 分离：取LB2 二次增菌液划线接种于PALCAM 琼脂平板和李斯特氏菌显色培养基上，于36 ℃±1 ℃培养24 h～48 h，观察各个平板上生长的菌落。典型菌落在PALCAM 琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷；典型菌落在李斯特氏菌显色培养基上的特征按照产品说明进行判定。5.3 初筛：自选择性琼脂平板上分别挑取5 个以上典型或可疑菌落，分别接种在木糖、鼠李糖发酵管，于36℃±1 ℃培养24 h；同时在TSA-YE 平板上划线纯化 API 20E ：以接种针从分离物的平板上挑取已分纯单个菌落至悬浮基物中。 IMViC试验 IMViC试验 I――靛基质试验，也叫吲哚（indol test）试验。细菌生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。大肠杆菌阳性。 M――甲基红（methyl red test）试验，检验细菌分解葡萄糖产生有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢葡萄糖产酸时，培养基就会变酸，使加入培养基的甲基红指示剂由橘黄色（PH6.3）变为红色（PH4.2）。 V――伏－普（Voges－Prokauer test）试验，用来检验细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端的能力。如丙酮酸。丙酮酸进行缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即伏－普反应阳性。大肠杆菌阴性。 C――柠檬酸盐（citrate test）试验,用来检测柠檬酸盐是否被利用。有些细菌可以利用柠檬酸盐为生长提供C源，不能分解柠檬酸盐的细菌则此培养基中无法生长。 I试验：琼脂斜面培养物接种色氨酸肉汤→培养36±1℃，24±2h→加入Kovacs氏试剂0.2～0.3ml，上层出现红色为靛基质阳性反应。（大肠杆菌阳性） MR－VP培养基：在 36±1℃培养48±2h。以无菌操作移取培养物1ml至13mm×100mm试管中，加5％1-萘酚乙醇溶液0.6ml，40％氢氧化钾溶液0.2ml和少许肌酸结晶，振摇试管后静置2h，如出现伊红色，为VP试验阳性。（加入肌酸的目的－胍基）（大肠杆菌阴性） 将MR－VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5滴甲基红溶液。如培养物变红，为甲基红试验阳性，若变黄色则为阴性反应。（变红的原因）（大肠杆菌阴性） Koser 枸橼酸盐肉汤：于36±1℃培养96h记录有无生长。 溶血环 我们接触的有溶血的细菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）。 很多细菌都可以产生溶血素而能够将血平板中的红细胞溶解形成清晰可见的溶血环。例如金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、李斯特菌、副溶血型弧菌等。 根据链球菌在血液培养基上生长繁殖后是否溶血及其溶血性质分为三类。 （1）α-溶血性链球菌：菌落周围有1-2mm宽的草绿色溶血环，也称甲型溶血，这类链球菌多为条件致病菌。 （2）β-溶血性链球菌：菌落周围形成一个2-4mm宽、界限分明、完全透明的无色溶血环，也称乙型溶血，因而这类菌亦称为溶血性链球菌，该菌的致病力强，常引起人类和动物的多种疾病。 （3）γ-链球菌：不产生溶