穴位敷贴治疗哮喘的机理研究.ppt

第一部分 穴位敷贴治疗支气管哮喘的机理研究 ?实验一 穴位敷贴对哮喘豚鼠外周血EOS计数及支气管肺组织EOS浸润的影响 1．材料与方法 1.1主要试剂 鸡卵清白蛋白、HE染色系列试剂。 1.2主要仪器 超声雾化仪、包埋机、切片机、XF9030自动血液细胞分析仪、 Olympus BX50F-3双目显微镜。 1.3实验动物 体重250g-350g豚鼠40只，雌雄不拘，由广州中医药大学动物实验中心提供。 1.4实验药物 麻黄、细辛、甘遂、延胡、白芥子。各药按比例研成粉末，用时以老姜汁调成糊状，切成0.5cm×0.5cm的方块，并撒以少量麝香。地塞米松注射液、0.9%的生理盐水。 1.5造模及分组 将40只Hartly豚鼠随机分为4组，每组10只：模型组、致敏加穴位敷贴组（穴位敷贴组）、致敏加地塞米松治疗组（地塞米松组）、对照组。哮喘豚鼠模型的制备采用Itoh K报道的卵蛋白吸入法：取豚鼠，先腹腔内注射10%卵蛋白生理盐水1ml，两周后每天用1%的卵蛋白溶液超声喷雾，每次30秒，连续1周，至豚鼠出现烦躁、呛咳、呼吸深快、点头运动及喘息。对照组用生理盐水1ml腹腔注射，2周后用同样方法吸入生理盐水。 1.6治疗方法 穴位敷贴组于造模成功，哮喘发作次日开始治疗。穴位选择：大椎、肺俞、肾俞。具体方法：将豚鼠颈背部穴位处用脱毛剂（8%的硫代硫酸钠）脱毛3×5cm2面积，用大块胶布将药物敷贴固定于穴位处。每次敷药6小时，隔日治疗一次，共治疗7次。地塞米松组采用腹腔注射地塞米松0.5mg/kg,治疗时间与次数同敷贴组。模型组造模成功后令其自然恢复，正常对照组不给予任何治疗。 1.7外周血EOS计数检查 采用XF9030自动血液细胞分析仪进行EOS自动计数。 1.8支气管肺组织普通病理学检查（HE染色） 1.9 结果判断 1. 外周血伊红染色，主要将血细胞中EOS染色，并计数其数目。 2. 病理学检查（HE染色）主要观察支气管肺组织中EOS浸润程度。其观察方法是经HE染色后，光学显微镜下每个样本取细支气管肺泡区随机观察5个高倍视野（10×40），计数其支气管肺泡组织浸润的EOS数，取平均值作为该样本EOS浸润计数。 1.10数据处理与分析 所测数据均以均值加减标准差（±s）表示，采用SPSS12.0统计软件分析数据，进行单因素方差分析：方差齐时采用LSD法（最小显著差异法）；方差不齐时采用Dunnett T3法。方差分析齐性检验水平α1＝0.05, 显著性检验水平α2＝0.05。 2.结果 研究结果显示，模型组豚鼠外周血EOS、支气管肺组织EOS浸润明显升高，与正常对照组比较差异有显著性（P0.01）；穴位敷贴组和地塞米松组外周血及组织EOS明显低于模型组（P0.01）；地塞米松组和穴位敷贴组之间外周血EOS差异无显著性（P0.05），但支气管肺组织浸润EOS差异有显著性（P0.01）。 3.讨论 EOS与迟发相哮喘反应、气道炎症及中医哮证的“宿根” 近年研究表明EOS是哮喘慢性气道变应性炎症的中心细胞（主要效应细胞），在迟发相哮喘反应（LAR）起关键作用。当哮喘患者被过敏原激发后，“信息”细胞及其释放的物质刺激更多的炎症细胞游走到气道，其中最值得注意的是EOS，其渗出发生在接触抗原后8-48小时。这种渗出对发展为LAR有特殊意义。当EOS从外周血募集到气道后，活化并释放出许多炎性介质，可使气道上皮破坏、微血管渗漏、黏膜水肿、腺体分泌增加，成为气道高反应性及气道阻塞的病理基础。绝大多数哮喘病人的气道炎症呈慢性过程，气道长期存在的、以EOS浸润为主的慢性炎症是哮喘呈慢性、反复、迁延发病的根本原因。 哮喘患者气道黏膜活检发现存在EOS及其毒性产物，并与LAR一致。近年的研究发现，骨髓中EOS的持续生成增多是导致慢性气道炎症和气道高反应性的重要原因。 大量研究表明：哮喘患者的气道以EOS持续聚集浸润为特征，哮喘发作时患者外周血及气道内EOS均明显增多，而病情缓解时EOS又明显减少。哮喘发作期外周血、BALF液中EOS高于缓解期，而缓解期仍高于正常对照组与激素治疗后。动物实验也得到相同结果。高晓明等进一步研究发现哮喘患者痰EOS计数与症状分级呈显著正相关，与肺功能（FEV1）呈显著负相关。刘学等检测发现血液中EOS的数量与气道高反应性呈显著正相关，同时还与血清IgE水平呈正相关。 综上所述，EOS主导迟发相哮喘反应（LAR）、是哮喘慢性气道变应性炎症的中心细胞，即使在缓解期仍高于正常人。这与中医关于哮喘内伏“宿根”的理论不谋而合，EOS浸润可能是哮喘“宿根”的微观基础之一。 穴位敷帖对哮喘豚鼠外周血及支气管肺组织EOS浸润的影响 本研究结果显示，模型组豚鼠外周血、支气