抗软腐病基因 aiiA 在魔芋块茎组织中特异性表达研究(可编辑).docVIP

抗软腐病基因 aiiA 在魔芋块茎组织中特异性表达研究 U D C 硕 士 学 位 论 文 抗 软 腐 病 基 因 aiiA 在 魔 芋 块 茎 组 织 中 特 异 性 表 达 的 研 究 学 位 申 请 人 :廖甜 甜 学 科 专 业 : 生物化 学与分 子生物学 指 导 教 师 : 乐超银 教 授 二○一 二 年五 月Classified code: Q7 Confidential degree: U D C: A Dissertation Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Science Specific expression of soft rot disease resistant gene aiiA in tubers of Amorphophallus konjac Graduate Student: Liao Tiantian Major: Biochemistry and Molecular biology Supervisor: Prof. Yue Chaoyin China Three Gorges University Yichang, 443002, //.na May, 2012三 峡 大 学 硕 士 学 位 论 文 三峡 大学 学位 论 文原 创性 声 明 本人郑重声明: 所呈交的 学位论文, 是本人在导师的指导下, 独立进行研究 工作所取得的成果, 除文中已经注明引用的内容外, 本论文不含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的作品 成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均 已在文中以明确方式标明,本 人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 学位论文作者签名: 日 期: I三 峡 大 学 硕 士 学 位 论 文 摘要 魔芋是多年生单子叶草本植物 ,其变态茎富含的葡甘聚糖具有广泛的应用价值 。 目前魔芋软腐病成为魔芋产业发展 的瓶颈, 利用基因工程技术获取抗软腐病魔芋新品 种成为魔芋软腐病生物防治的有效 手段。 本研究构建了含有块茎特异性启动子 patatin 和抗软腐病基因 aiiA 的植物表达载体,并通过农杆菌介导法遗传转化魔芋,拟以此 途径获取抗软腐病魔芋植株。主要 包括以下研究内容: 以 pET28a 为载体质粒 , 根据 GenBank 登录 号 GU339170.1 的 aiiA 基因序列设计 引物, 以 苏云金芽孢杆菌 218 基因组 DNA 为 模板扩增克隆 aiiA 基因, 构建重组原核 表达载体 pET28a-aiiA ,并利用热激法成功转化大肠杆菌表达菌株 E.coli BL21DE3 。 在 37 ℃下培养至菌体 OD 至 0.4 , 添加 IPTG0.6mmol/L 并在 20 ℃ 下分别诱导培养 600 12 h 、16 h、20 h 、24 h 后,超声波破碎菌体提取粗蛋白,经 SDS检测,可见 28 KD 大小的目的基因 表达产物。 经抗魔芋软腐病病原菌活性检测, 结果显示蛋白粗 提液对魔芋软腐病病原菌生长有明 显的抑制作用。 以花魔芋小球茎和根状茎为外 植体, 以 MS 培养基为基本培养基, 添加不同激素 诱导和分化培养, 将诱导的魔芋丛生芽切成单株后进行生根培养。 本实验中采用愈伤 诱导培养基为 MS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 1.0 mg/L , 新鲜材料接种 后 50-60 天, 形成 的愈伤组织可用于后续的遗传转化 。 以 pBI121 为载体质粒 , 根据 GenBank 登录号 GQ352473.1 的 patatin Class Ⅰ基因 启 动 子 序 列 设 计 引 物 , 从 马 铃 薯 幼 嫩 球 茎 基 因 组 DNA 中 克 隆 块 茎 特 异 性 启 动 子 patatin 。 设计含有 BamH Ⅰ单酶切位点的特异引物, 从苏云金芽孢杆菌 218 中克隆 aiiA 基 因 。 构 建 含 aiiA 基 因 的 抗 软 腐 病 植 物 表 达 载 体 pBI121-patatin-35S-aiiA 和 pBI121-patatin-aiiA 。利用冻融法,将重组植物表达载体转化到农杆菌 LBA4404 中, 并通过农杆菌介导法,对魔芋小球 茎和根状茎诱导形成的愈伤组织进行遗传转化。 采 用 本 课 题 组 已 建 立 的 魔 芋 遗 传 转 化 体 系 , 用 含 有 重 组 植 物 表 达 载 体 pBI121-patatin-aiiA 和 pBI121-patatin-35S-aiiA 的农杆菌遗传分别转化魔芋愈伤组织 , 将 共 培 养 后 的 愈 伤 转 接 至 分 化 培 养