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染色体制备经验手册
人类染色体标本制备经验手册
目 录
第一部分
人类染色体研究的实验室建设………………1页
第二部分
各类器械清洗与常用试剂配置………………4页
第三部分
人类染色体标本制备方法……………………11页
第四部分
探讨染色体标本制备技术中的若干问题……22页
第五部分
附录……………………………………………25页
第一部分
人类染色体研究的实验室建设
一、实验室要求
1、准备室(约30平方米):供清洗玻璃仪器、配制试剂仪器包装消毒及制片场所,还必需配置耐酸碱水池、实验操作台、药橱等设施。并能合理放置冰箱、电热干燥箱、离心机、纯水器、消毒锅、天平等仪器,以方便使用。
2、无菌室(约25平方米):用作细胞的接种培养、配备培养基。分为更衣室(约4平方米)、缓冲室(约6平方米)、接种室(约15平方米)。配备空调机、传递窗、离心机、倒置显微镜、超净工作台、臭氧发生器或紫外灯、培养箱等设备仪器。
3、分析室(约15平方米):为观察分析核型、整理资料场所。配备高清晰度带照相装置的显微镜,电脑、打印机、办公桌等。
二、设备仪器
(一)仪器
1、超净工作台一台
2、光学显微镜二台(可以安装染色体软件分析系统)
倒置显微镜与带照相装置的正立显微镜各一台。倒置显微镜用作细胞培养;正立显微镜用作核型分析,有条件的单位可配备染色体分析软件、电脑、打印机等。
隔水式恒温培养箱一台
开展产前检查的单位,最好购买二氧化碳培养箱。
4、电热干燥箱一台
5、冰箱二台:普通冰箱和低温冰箱各一台
6、酸度计一台(可略)
7、纯水器(电阻率18兆欧姆)一台;(可略)
8、高压灭菌锅一台(可略)
9、电热磁力搅拌器一台(可略)
10、真空泵(无油)一台(可略)
11、电子天平二台(万分之一天平与普通天平各一台)
12、水平式离心机二台
转速0-4000转/分,10毫升/管,大容量与小容量各一台。大容量的供制片用,小容量的放置无菌室供细胞培养用。
可调移液器若干支:规格从5-5000微升若干支
14、超声波清洗器一台(可略)
15、水浴箱(0-100℃可调)
(二)玻璃器皿与耗材
1、培养瓶:15毫升链霉素瓶,25毫升小方瓶(建议采用一次性培养瓶)。
2、刻度离心管(10毫升)50支
3、量筒(10-1000毫升):各种规格各一个。
4、不锈钢滤器(各种规格各一个)及滤膜(孔径中0.25微米)一盒
5、注射器(1-20毫升)若干
6、盐水瓶(100-500毫升)若干
7、试剂瓶(磨口)10个
8、蒸馏水瓶(3万或5万毫升)2个
9、染色缸1个
10、研钵1个
11、酒精灯2盏
12、滴管(带吸头)50支
13、载玻片若干
14、试管架和离心管架各2个
15、各种镊子与剪刀若干
16、铝饭盒(供盛培养瓶滴管等器械消毒时使用)
17、烧杯(容量50-2000毫升)各一个
18、抽滤瓶(1000-2000毫升)一个
19、各种规格的可调移液器吸头若干
20、载波片盒(50-100片)若干
* 玻璃器材的材质应采用中性硬质玻璃或硼硅玻璃
三、常用药品及试剂
1、培养基(RPMI 1640、HamF10)
2、植物凝集素(phytohemagglutinin简称PHA)
3、肝素钠(抗凝剂,医用级)
4、血清(小牛血清、胎牛血清)
5、抗菌素(青霉素、链霉素)医用级
6、秋水仙素(秋水仙碱)
7、氧化钾(分析纯)
8、碳酸氢钠(分析纯)
9、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠(分析纯)
10、乙二胺四乙酸二钠(EDTA,分析纯)
11、三羧甲基氨基甲烷(Tris,分析))
第三部分
人类染色体标本制备方法
一、人体外周血淋巴细胞染色体标本的制备(已经商品化)’s F10培养液 80%
胎牛血清 20%
细胞生长因子 适量
双抗 100单位/毫升
调PH=6.6-6.8,无菌条件配制,分装冰冻备用。抽取的羊水在无菌条件下,平衡离心,离心速度1000-1200转/分钟,时间8-10分钟,弃上清,留下1毫升上清与沉淀的细胞打匀,接种到25毫升方形的培养瓶内,加入5毫升预热37℃的羊水培养液,轻轻打匀,置37℃培养箱(最好采用CO2培养箱)。静止培养6-7天。接种量,通常10毫升羊水的细胞接种一瓶。
3、6-7天后,镜下观察细胞生长情况,若羊水细胞已贴壁,并形成许多细胞小岛,即进行换液。
4、换液时,轻轻吸去旧的培养液,加入新鲜的培养液5毫升
5、细胞换液后生长加快,隔日观察,当细胞生长旺盛,出现许多透亮圆形饱满的细胞时(一般约为14-30天),可收集细胞进行染色体制片。
6、若换液后,细胞生长缓慢,仍旧只有几个孤立细胞小岛,或者细胞形态只有成片的树皮状的细胞,无圆形的细胞出现。就
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