王静杰 开题报告ppt.ppt

罗氏沼虾促雄性腺激素基因克隆与表达 专业：海洋生物学 方向：海洋经济动物发育生物学 姓名：王静杰 导师：李广丽教授 目录 课题研究目的及意义 国内外研究现状 罗氏沼虾促雄性腺的研究 罗氏沼虾促雄性腺激素研究 研究内容 研究方法 技术路线图 创新点 研究基础及进度安排 课题研究目的及意义 研究对象：罗氏沼虾 成虾个体一般雄性大于雌性 养殖范围广 研究目的： AGH基因序列 时空表达 ——不同组织 胚胎发育不同时期 研究意义： 为甲壳动物的遗传育种和性别的定向控制提供理论依据。对实现某些经济虾蟹类的单性化养殖，促进名优水产养殖业的可持续发展具有重要意义。 罗氏沼虾促雄性腺的研究 促雄性腺Androgenic Gland, AG 促雄性腺激素Androgenic Gland Hormone, AGH 罗氏沼虾促雄性腺的研究 1980年 Nagamine ：促雄性腺对于雄性第二性征的产生有决定作用。 1990年Sagi ：去促雄性腺，获得了雌性个体，再以此个体与正常的雄性个体交配，得到全雄的群体。 1992年 Malecha：移植促雄性腺，培育出性逆转的全雄性个体。 2006年 Aflalo和Wikrom Rungsin：去促雄性腺的雄虾反转成雌虾与雄虾杂交培育出了全雄罗氏沼虾家系。 罗氏沼虾促雄性腺激素研究 张银华 ：液相色谱-电喷雾电离-质谱联用，分离罗氏沼虾AGH类似物，得分子量17480u为主要组分的混合蛋白。 刘萍：构建罗氏沼虾促雄性腺 cDNA文库，12条 EST（表达序列标签）序列，其中4个 cDNA功能基因，4个 rRNA，4个新基因。 马文明：罗氏沼虾AGH类似物（rMAL），建立了对促雄性腺提取物及其类似物的生物学活性分析和RNA干扰的有效方法。 研究内容 雄性腺激素基因cDNA克隆； 雄性腺激素在组织分布； 雄性腺激素的胚胎表达。 研究方法 引物设计 提取促雄性腺的总RNA 两步法RT-PCR DNA纯化回收 连接，转化 质粒PCR，琼脂糖凝胶电泳检测 测序 半定量RT-PCR检测AGH基因时空表达 引物设计 摘录GenBank中已登录的AGH序列，应用DNAssist 2.0比对找出保守区，利用Primer5.0设计简并引物。 遵循引物设计原则： 发卡结构 Dimmer 错配 总RNA提取 TRizol（异硫氰酸胍）法 组织匀浆 氯仿，异丙醇抽提 75%乙醇洗涤 溶解RNA RNA易降解 解剖器、吸头、离心管需要RNase Free 戴口罩，勤换手套 两步法RT-PCR 逆转录合成cDNA第一条链 PrimeScriptII1stStrand cDNA Synthesis Kit试剂盒 PCR（聚合酶链式反应） 即用PCR扩增试剂盒 出现非特异性扩增 重新设计引物或者使用巢式PCR 适当降低模板或引物浓度 适当减少酶量 降低镁离子浓度 适当提高退火温度 减少循环次数 DNA纯化回收 通用型DNA纯化回收试剂盒 DNA回收效率较低或者未回收到目的片段 延长水浴时间，使胶块充分溶解 第一次使用时按比例添加乙醇，并在试剂瓶上做标记 离心转速不够，溶液中的DNA没有与硅胶膜充分结合，使用离心力≥12,000 g的离心机，如达不到该转速，可通过适当延长离心时间确保胶溶液完全通过硅胶膜 连接，转化 连接：pGM-T克隆试剂盒 转化 连接产物与感受态细胞混合（冰浴） 42℃水浴中热击90秒后迅速置于冰上冷却3-5分钟 37℃振荡培养使菌体复苏 涂平板（Amp+），培养12~16h，筛选阳性菌株 无克隆菌 可通过转化pUC18/19等未切割的可用于抗性筛选的质粒，检测感受态细胞的转化效率和转化操作是否正确 感受态细胞失活 连接酶失效 用时于冰上融解；适量分装 UV照射过久导致PCR产物变性 切胶动作要快，尽量缩短UV照射时间 半定量RT-PCR鉴定AGH基因组织分布 分别取活虾的雄性腺、卵巢、肝胰脏、脑、肌肉组织，提取总RNA。并用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度及纯度。 合成cDNA第一条链。 PCR扩增是以逆转录的cDNA第一链为模板，以特异性引物扩增所要检测的mRNA。利用半定量 RT-PCR法对mRNA进行分析，最关键的就是要优化各步实验条件，以构建最佳的PCR扩增反应体系。 琼脂糖凝胶电泳检测AGH基因表达量最丰富的组织。 半定量RT-PCR不同胚胎发育时期AGH基因表达 仔虾后10天至60天以5天为一阶段，不能分辨雌雄的取其头胸甲部分（包括第五步足基部），能分辨的取其促雄性腺体及同一个体的肌肉组织 提取总RNA 半定量RT-PCR 琼脂糖凝胶电泳，检测AGH基因的表达量最丰富的时期。 技术路线图 创新点