生物合成氰氟草酯的脂肪酶的分离及其酶学特性研究-生物化工专业论文.docxVIP

生物合成氰氟草酯的脂肪酶的分离及其酶学特性研究 摘 要 随着农业的快速发展，人类对农药的需求量不断增加，其中的氰氟草酯作 为一种水稻除草剂，正被广泛的使用。但它的生产主要还是以化学方法为主， 化学法对原料造成浪费并对环境造成很大污染。酶法的合成正在被积极研究， 也取得了一定的突破。目前脂肪酶被用于氰氟草酯的合成，已经形成了优势的 合成方法。但是优质脂肪酶主要是由国外生产，所以要打破国外的垄断，减少 对国外脂肪酶的依赖。本课题正致力于筛选出可用于催化合成氰氟草酯的脂肪 酶，因此开展了此课题的研究。 筛选获得 13 株产脂肪酶的菌株，对这些菌株进行了初步鉴定，经革兰氏染 色之后，S1、S2、S3、S4、S5、S6、Z1、Z2、Z3、Z5、Z6、Z7 菌株在显微镜 下均呈现紫色，说明是革兰氏阳性菌；Z4 菌株在显微镜下呈现红色，说明是革 兰氏阴性菌。考察所筛选菌株的有机溶剂耐受性和催化氰氟草酯合成能力。发 现菌株 S5 具有良好的有机溶剂耐受性并且催化合成氰氟草酯合成能力较强， 产率达到 9.8%。 对其中具有催化氰氟乙酯酯交换合成氰氟草酯的能力的菌株 S5 进行生长 条件考察，该菌株的最佳培养条件为温度 35 ℃，初始 pH 8.5，且对 NaCl 耐受 性达到 6%左右；在对其进行生长曲线考察时发现，在 22 h 左右达到最大生长 量，在对其进行发酵产酶考察时发现，产酶量在 25 h 左右达到最大。经形态学 和分子生物学鉴定该细菌同蜡状芽孢杆菌同源性达到了 99%，并与生理生化实 验、生长条件、耐盐度的考察的结果对比，发现与伯杰氏细菌鉴定手册上的描 述一致，可进一步确定此菌株为腊质芽孢杆菌属，命名为 Bacillus cereus TRY。 为提高菌株 Bacillus cereus TRY 的正丁醇耐受性，考察了其最大正丁醇耐 受浓度在 2 %左右，以此浓度作为驯化浓度进行耐受性驯化。期望得到在催化 氰氟草酯合成中具有对正丁醇更稳定的脂肪酶。 对其中具有催化氰氟乙酯酯交 换合成氰氟草酯的能力的菌株 Bacillus cereus TRY 进行产酶条件考察，通过对菌株培养成分中的碳源、氮源、诱导物、 表面活性剂、金属离子的条件因素的考察，确定最适培养基成分为：玉米粉 20 g/L，牛肉膏 15 g/L，橄榄油体积分数 10 %，tw-80 体积分数 5 %，Mg2+ 1 mg/mL。 优化的产酶发酵条件为温度 35 ℃、初始 pH 8.0、发酵时间 26 h。最终优化后 的酶活力为 6.76 U/mL。 通过对酶的特性考察发现：酶的最适 pH 9，最适温度 37 ℃，菌株 Bacillus cereus TRY 产生的脂肪酶具有较好的热稳定性，在温度不大于 60 ℃时处理 60 min，酶活力变化很小，同时脂肪酶在 pH 7.5～9.5 时具有较好的 pH 稳定性。 通过胞内、胞外酶考察，发现两者都可以催化氰氟草酯的合成，也都有一 定的水解活力，所以菌株 Bacillus cereus TRY 所产脂肪酶为胞外酶，优化后的 发酵液用盐溶盐析法分离酶蛋白，分离最终酶的比活力为 1.6×10-2 μmol/μg， 分离出的低酶活力的脂肪酶冻干后在有机相中催化氰氟草酯的合成，催化活力 微弱。因此直接考察了冻干发酵液的有机相催化氰氟草酯的合成，有一定的催 化活力。用没经过盐析分离的冻干后的发酵液所得粗脂肪酶催化 L-抗坏血酸脂 肪酸酯衍生物的合成发现，此菌株产脂肪酶无催化 L-抗坏血酸脂肪酸酯衍生物 合成的能力。 关键词： 氰氟草酯，脂肪酶，酶促有机反应，Bacillus cereus，有机溶剂耐受性 Isolation and characterization of lipase for the biosynthesis of Cyhalofop-butyl ABSTRACT With the rapid development of agriculture, human need more and more Cyhalofop-ethyl as a rice herbicide. But at present we mainly produce Cyhalofop-ethyl used chemical methods.We waste the raw material and cause great environmental pollution used chemical methods. Enzymatic synthesis has made some breakthroughs. Lipase is used synthesis of Cyhalofop-ethyl.But t