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HPLC法测定羟基喜树碱在肾组织中的分布 【摘要】目的：建立测定小鼠肾组织中10-羟基喜树碱浓度的方法。高效液相色谱-荧光检测方法，以CPT为内标，甲醇/水为流动相，采用梯度洗脱方式，在激发波长为383nm，发射波长为553nm条件下，实现HCPT及内标CPT的同时测定，小鼠肾组织中的内源性物质不干扰检测，方法的准确度、精密度、灵敏度可达到分析的要求。该方法成功应用于小鼠肾组织中HCPT的药代代谢动力学研究。 【关键词】高效液相色谱法；小鼠；肾脏；10-羟基喜树碱；组织分布 喜树碱（Camptothecin，CPT）是从我国珙桐科植物喜树（CamptothecaacuminataDecne）中提取得到的一类天然生物碱[1]，具有显著的广谱抗肿瘤活性[2]。10-羟基喜树碱（10-hydroxycamptothecin，HCPT）是喜树碱的天然衍生物，是我国临床应用的喜树碱类抗肿瘤药物。目前已经有文献[3～8]报道检测血浆中HCPT含量的高效液相色谱法，但一般采用紫外检测器及使用外标法定量，灵敏度和准确度较低。本研究采用荧光检测器，以CPT为内标，乙醚为萃取溶剂制备样品，建立了一种选择性好、灵敏度高的测定小鼠肾组织中HCPT浓度的高效液相色谱法，并将其应用于HCPT的肾组织中药动学研究。 1仪器与材料 1.1仪器:高效液相色谱系统，包括1525型二元泵、717型自动进样器、2475型荧光检测器（美国Waters公司）；SorvallLegendMicro17型离心机（美国Thermo公司）；H-H-2数显恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；WH-986静音混合器和WH-861漩涡混合器（江苏省太仓市科教器材厂）。 1.2试药:HCPT（批号：081020，纯度：99％）、CPT（批号：080510，纯度：99％）购自哈尔滨峰源高科技开发有限公司；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。 1.3动物：洁净级ICR小鼠，♂，体重20～25g，购自黑龙江中医药大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK黑2008004。 2方法与结果 2.1色谱条件：色谱柱：LunaC1（8250mm×4.6mm，5μm）；流速：1.2mL·min-1；荧光检测器检测；激发波长：383nm；发射波长：553nm；流动相：水（A）-甲醇（B），梯度洗脱，详细梯度洗脱条件见表1。 ** 2.2溶液的制备:精密称取HCPT或CPT各1mg，用甲醇溶解，定容至25mL，分别得浓度为40μg·mL-1贮备液，分装，－80℃冰箱保存备用。试验时，用甲醇将HCPT贮备液稀释成浓度分别为1.25、2.5、5、10、20、40、80ng·mL-1的系列标准溶液；用甲醇将CPT贮备液稀释成浓度为200ng·mL-1的溶液作为内标溶液，－80℃冰箱保存备用。 2.3动物实验:雄性小鼠禁食、自由饮水12小时，共3只小鼠按80mg·kg-1羟基喜树碱的剂量灌胃给药。给药后24小时，取出肾组织，用生理盐水去除表面浮血，放入离心管中，置-20℃冰柜冷冻保存。RP-HPLC法测定生物样品中HCPT的含量，所得数据用药动学计算软件（Kinetics5.0）分析。 2.4样品制备 2.4.1标准曲线的制备:以HCPT标准肾组织样品浓度为横坐标，以色谱图中HCPT峰面积与CPT峰面积之比为纵坐标绘制浓度标准曲线，采用加权最小二乘法进行回归运算，求得直线回归方程即为标准曲线。HCPT在检测浓度线性范围为1.25-80ng·mL-1。小鼠肾组织样品典型的标准曲线回归方程Y=0.1627x+0.19090，r2=0.9993生物样品的制备。 2.4.2空白组织（肾组织）样品制备:取空白组织匀浆100μL，依次加入内标溶液、HCPT系列标准溶液各100μL和1%乙酸200μL，加入乙醚约700μL，将混合液涡旋1min、静音混合60min后，13000rpm离心20min，萃取液置于干净的离心管中，40℃水浴，空气流吹干，最后用乙腈200μL溶解，12000rpm离心5min，取上清液50μL进样。 2.4.3给药后组织（肾组织）样品制备：取乙腈100μL代替空白组织，依次加入内标溶液、给药后组织匀浆各100μL和1%乙酸200μL，加入乙醚约700μL，将混合液涡旋1min、静音混合60min后，13000rpm离心20min，萃取液置于干净的离心管中，40℃水浴，空气流吹干，最后用乙腈200μL溶解，12000rpm离心5min，取上清液50μL进样。 2.5系统适用性试验：按“空白组织分析样品的制备”方法处理并分析，得到空白组织的色谱图；同法操作，获得一定浓度HCPT标准样品的色谱图及小鼠灌胃给药后组织样品的色谱图（图1）。结果表明，肾组织中