乙酰胆碱受体α亚基97116肽段制作实验性重症肌无力模型研究.docVIP

乙酰胆碱受体α亚基97-116肽段制作实验性重症肌无力模型的研究 作者：胡任飞，宋雅芳*，刘友章，李良龙，黄晓燕，陈裕杲，姬爱冬， 张久梅 【摘要】 目的研究用乙酰胆碱受体α亚基97-116肽段制作实验性重症肌无力(EAMG)的动物模型。方法给实验组Lewis鼠皮下注射人工合成的鼠源性乙酰胆碱受体α亚基97-116肽段，观察接种后大鼠一般情况及体重、Lennon评分变化，应用低频重复电刺激检测电衰减反应，并与对照组鼠比较。结果模型组大鼠在第1次强化免疫后逐渐出现肌无力症状，体重增长缓慢或下降，甚至消瘦，毛发变得暗淡、粗糙甚至脱落，再次加强免疫后上述症状明显加重。Lennon临床评分29只评分在1级以上，并行RNS检测，36只模型鼠中32只5 Hz重复刺激电衰减率gt;10%，而对照组衰减率均lt;10%，两组比较差异有显著性(Plt;0.01)。结论皮下注射鼠源性乙酰胆碱受体α亚基97-116肽段可成功制作实验性自身免疫性重症肌无力大鼠模型。 【关键词】 重症肌无力; 乙酰胆碱受体; α亚基; 肽段 　重症肌无力(Myasthenia gravis, MG)是乙酞胆碱受体抗体(AchR-Ab)介导的、细胞免疫依赖和补体参与的一种自身免疫性疾病，病变主要累及神经肌肉接头处突触后膜乙酰胆碱受体，导致神经肌肉接头处传递功能障碍。 　　用从电鳗电器官中提取的AchR作为免疫原主动免疫易感鼠来建立EAMG模型，这是经典的造模方法。电鳗的电器官中含有丰富的AchR，但不足之处是电鳗难以捕获且提纯过程复杂，代价昂贵，限制了该法的大规模应用。 　　本研究采用鼠源性乙酰胆碱受体α亚基97-116肽段作为免疫原接种Lewis大鼠，制作EAMG模型，观察大鼠肌无力的变化，为研究重症肌无力的发病机制和治疗提供一种较好的实验动物模型。 　　1 材料 　　1.1 动物SPF级8周龄的Lewis大鼠45只，雌性，平均体重(155.24±15.77)g，在自然环境条件下饲养;由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号码：SCXK-(京)2007-0001。随机取6只作为对照组(A组)，剩余大鼠进行EAMG造模，第6周末，造模大鼠还剩36只，经肌电图检测后，确定成模32只。再将其随机分为模型组、强的松组、健脾祛湿方高剂量组(相当于成人剂量的16倍)、健脾祛湿方低剂量组(相当于成人剂量的8倍)，分别为B、C、D、E组，每组各8只，共5组。 　　1.2 试剂鼠源性AchR-α亚基97-116肽段序列(the rat sequence 97-116 of the AchR α subunit,R97-116)：DGDFAIVKFTKVLLDYTGHI，由西安美联生物技术有限公司合成。 　　完全福氏佐剂(complete freund’s adjuvant，CFA)、不完全福氏佐剂(incomplete freund’s adjuvant，IFA)、磷酸缓冲液(Phosphate Buffer Solution，PBS)均购自美国Sigma公司;新斯的明、阿托品均由广州中医药大学第一附属医院药剂科提供。 　　2 方法 　　2.1 EAMG模型建立本实验造模方法参考Baggi等[1]和许文华等[2]的制备方法复制EAMG模型。具体方法：首先将R97-116、CFA、PBS三者按1∶1.5∶1.5的比例充分混匀制成免疫乳剂;首次免疫：取乳剂200 μl(含R97-116∶100 μg)于造模鼠足垫、腹部、背部多点皮下注射，对照组皮下注射等量PBS;首次免疫后30 d及45 d，将R97-116、IFA、PBS三者按1∶3∶3的比例充分混匀制成免疫乳剂后，再取乳剂200 μl(含R97-116∶50 μg)强化接种，对照组同样注射等量PBS。 　　2.2 模型评估标准 　　2.2.1 临床评估临床评估：通过测量体重和肌力来评价疾病严重性。①实验前及接种后每周2次称重。末次免疫2周后观察其摄食、姿势及活动情况。②测量肌力(对于轻度肌无力者给予疲劳试验即让鼠重复抓握笼顶30 s再测量)：采用Lennon等[3]的分级法予以临床评分;肌力具体分级为：0级：没有肯定的肌无力表现;1级：撕咬无力，四肢力量差，在光滑地面上前肢打滑，活动减少，且容易疲劳;2级，明显无力，在抓握前就出现震颤、低头、隆背、抓握力弱;3级，在抓握前即有严重的肌无力表现、无力抓握、濒死状态;4级，死亡。动物症状在以上4者之间可分别以0.5，1.5，2.5计分。结果以每个时间点的平均数表示。 　　2.2.2 新斯的明试验[4]用腹腔注射法给予新斯的明(37.5 μg/kg)和硫酸阿托品(15 μg/kg)，12 min后大鼠肌无力症状可缓解，持续2～12 h。 　　2.2.3 RNS检测电衰减反应[5