细胞生物学的研究方法_002.docVIP

细胞生物学教案 邵邻相 PAGE PAGE 1 第三章 细胞生物学研究方法 一. 教学目标：1了解主要工具和常用方法，侧重掌握基本原理和基本应用；2认识工具和方法与学科发展的相关性。学会在教学和科研中应用这些实验方法。 二．重点：仪器方法的基本原理和基本应用。 三．难点：电镜样品的生物制样、放射性同位示踪技术。 四．授课方式与教学方法：讲授、讨论、多媒体辅助教学。 五．教学内容: 第三章 细胞生物学研究方法 如同生物学其他分支学科一样，技术的进步在细胞生物学的建立与发展中起着巨大的作用。没有显微镜的发明就不会提出细胞学说；同样，没有电子显微镜技术和与分子生物学技术的结合，就很难想象细胞生物学会有今天这样的进展。细胞生物学研究方法是细胞生物学不断向前发展的重要推动力量。 1.1 光学显微镜 1.1.1 D＝0.61λ÷N·A N·A＝n·sin(a/2) n：折射率 D：分辨率 N·A：镜口率。低倍镜0.28，高倍镜0.65，油镜1.25. 可见光：λ＝400～760 nm, 一般显微镜放大倍数在1000～1500倍，分辨率0.2mm. 紫外光：λ＝390～130 电子束：100V, λ＝1.23； 10,000V, λ＝0.122；100,000V λ＝0.0387 1.1.2紫外线显微镜 波长短于400nm，分辨率提高一倍。 可观察细胞内具有紫外线吸收能力的物质如核酸（260nm）、蛋白质（280nm）。 镜片石英玻璃，价格昂贵。 1.1.3 叶绿体在紫外线照射后发出荧光。 可加荧光染料如酸性品红、 啶橙，中性红、甲基绿。 1.1.4 暗视野显微镜 利用丁达尔现象，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜。背景为黑，观察核、线粒体，分辨率可提高40倍。 1.1.5相差显微镜和微分干涉显微镜 相差显微镜：由光程差变成振幅差，明者更明，暗者更暗，立体感增强。物 镜中增加一环形相板，光源聚光器中增加一环形光阑。 微分干涉显微镜：利用平面偏振光，光线经棱镜折射后分成两束，在不同时间经过样品后两束光再会合，从而样品中厚度上的微小差异就转化成明暗区别，增加反差。观察培养的活细胞。 1.1.6偏光显微镜 在聚光镜前增加偏光器，在镜筒中放分析器。 可观察细胞中晶体结构物质。 1.1.7数字成象显微镜 与计算机相连，提高信／噪比，提高分辨率。可进行动态观察。缩时显微电影。 1.1.8 激光共焦点扫描显微镜 一束光线通过聚焦成点，在样品表面扫描后成象。它是一个扫描光学显微镜，因为在一个时间试样上只有一个点被照亮。随着试样被扫描，像素的积累便构成了图像。因为物镜的焦平面很薄（只有0.5皮米）所以能够获得试样的真正光学断面。所有在焦平面以上或以下的图像数据都到不了探测器。随着焦平面的上升或者下降（Z轴），可以得到试样的分层图像并存储起来，这些分层图像就由计算机重构成三维图像。 主要系统组成：激光源、共聚焦显微镜（包括物镜前和探测器前针孔和光学显微镜、探测器计算机以及图象输出设备（显示器、彩色打印机和照片幻灯制作设备）。 样品要求：样品制备无特殊要求；各种染色、非染色、荧光标记的组织（包括活组织）、培养细胞、粘 附细胞、细胞涂片、石蜡切片、冰冻切片。 1.2 电子显微镜 1.2.1光镜显微镜与电子显微镜的比较 ? ? 光学显微镜 学显微镜 光学显微镜 光学显微镜 电子显微镜 子显微镜 发光源 发光源 灯泡 泡 电子枪 子枪 光源 可见光、紫外光可可见光、紫外光 见光、紫外光 紫外 光 光可见光、紫外光 电子束 透镜 玻璃透镜 璃透镜 电磁透镜 磁透镜 真空系统 空气 真空 成象色彩 彩色 色 单色 色 样品要求 无需脱水 需脱水 水 1.2.2透射电镜制样 观察样品的内部结构。 样品常规制备：样品切成小块（１立方毫米）。 1～5％戊二醛固定１小时以上，清洗，１％锇酸固定１小时，清洗。 乙酸系列脱水，30%，50%，70%，80%，90%，95%，100（3次），各15min. 浸透 包埋 切片 染色 干燥 观察 1.2.3暗场(负染色)电镜技术 采用负染色的方法，使重金属染料沉积在样品的周围及凹陷处，从而使样品本身成为浅色而被观察。 可观察DNA、RNA、颗粒、纤维、病毒、细菌、质膜、细胞器。 1.2.4扫描电镜制样 观察样品的表面结构。 样品常规制备：取材→ 固定 →脱水 →置换 →CO2临界点干燥 →安置样品 →喷镀 →电镜观察 乙醇脱水，乙酸异戊酯置，导电胶把样品粘在样品台上。样品台上。 扫描电镜原理.电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象。 .CO 2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题 1.