[基础医学]病理学新技术.ppt

（2）全cosmid和YAC的CISS 在进行人类单一序列基因片段的FISH时，为了提高杂交检出的效率，需用含大插入片段的克隆载体。如用整个cosmid克隆的基因组片段或用YAC克隆的基因片段作为探针进行CISS杂交。 5．反向染色体涂染（Reverse chromosome painting） 在细胞遗传学研究中经常遇到的问题之一是：很难辨认一条新生的染色体或染色体上的一段额外来源。上述各种技术常对此束手无策。因为带型不具染色体特异性；而着丝粒特异性探针与单一染色体文库探针虽具染色体特异性，但无法确定选用哪一条。 新的FISH方法如下：首先利用流式细胞分类方法分离出异常的染色体→利用染色体显微解剖技术分离出异常的染色体区带→用PCR法扩增异常的单一染色体或染色体区带DNA→用PCR产物作为探针库与正常中期染色体进行CISS杂交→显示出在正常染色体作为异常染色体起源的部分。 故所谓反向染色体涂染是指用异常染色体的DNA作为探针，在正常染色体中寻查其起源部分的方法。 四、FISH的应用 1．基因定位与基因制图（Gene mapping） 原理前面已叙述。 FISH已经极大地加速了人类基因定位和基因制图的进程。 2．基因诊断(Gene diagnosis) 精确、直观、明了 3．间期细胞遗传学（Interphase cytogenetics） 4．FISH在肿瘤生物学中的应用 （1）肿瘤细胞遗传学（Onco-cytogenetics） （2）基因定位：FISH可用于分离出的癌基因与抑癌基因初步定位 （3）病毒基因插入基因组部分的检测： 虽然逆转录病毒以激活原癌基因为主，也有象腺病毒、HPV、SV40等病毒以蛋白产物与抑癌基因蛋白产物相互作用而诱导细胞转化。但病毒基因特别是DNA病毒多有病毒基因成分插入到人基因组。利用FISH可以检测到病毒整合到人基因组中的情况，对深入研究病毒致癌机理，以及检测、防治均具有重要意义。 （4）基因的扩增与缺失 原癌基因的激活与抑癌基因的失活是目前肿瘤研究的热点。 已知原癌基因的激活方式有：突变、基因扩增、易位、病毒序列插入。 抑癌基因的激活方式有：点突变、基因缺失。 FISH为研究基因的扩增和缺失提供了新的方法，能将基因扩增和染色体重复分开。 第九节 比较基因组杂交技术 比较基因组杂交技术(comparative genome hybridization,CGH)。 其基本原理是用不同的荧光染料分别标记正常人基因组DNA与肿瘤细胞DNA，然后与正常人中期染色体杂交，通过检测染色体上两种荧光（红、绿）的相对强度比率，两组DNA相异部分会显出颜色偏移，从而可计算出DNA的缺失与放大，从而了解肿瘤组织DNA拷贝数的改变，并能同时在染色体上定位。这样的方法使我们只要从新鲜组织或石蜡包埋肿瘤组织中提取少量DNA，就可进行全基因组检测。应用CGH技术检测癌变过程中的不同阶段，肿瘤进展的不同时期及不同类型肿瘤的非随机性染色体改变，有助于从分子细胞遗传学角度了解肿瘤的发生发展，对发现肿瘤遗传学标记，初步查寻肿瘤相关基因的位置均具有重要意义。其对检测原癌基因扩增较为灵敏，但对基因缺失敏感性则相对较弱。 图 食管癌细胞系CGH图 第十节 组织培养与细胞培养 细胞培养（Tissue and cell culture）是将活体内部分组织细胞取出后在人工条件下使其生长，繁殖和传代。在体外对细胞进行生命活动，细胞癌变等问题研究。还可施加实验因子进行形态、生化、免疫、分子生物学观察，已广泛应用与病理学的各个研究领域。 原代培养：由体内直接取出组织或细胞进行培养。优点：离体时间短遗传性和体内组织相似。宜作细胞形态，机能，分化研究。 传代培养：把细胞自原代培养的培养瓶中分离、稀释而移至另一新的培养瓶中的操作程序即为传代或再培养。以便持续培养，得到大量同种细胞，细胞株，维持细胞种延续。 图 食管癌细胞系肿瘤细胞培养图片 图 体外神经干细胞培养 易混概念并解释 组织与细胞化学检查和免疫组织与细胞化学检查 前者的原理是细胞中的化学成分和其相应的底物呈一系列的化学反应，形成于显微镜下可见到的反应产物如苏丹Ⅲ法（使中性脂肪着色）、普鲁氏蓝反应法（显示含铁血黄素）、Feulgen法（显示DNA）；而后者是应用抗原与抗体接触后可形成“抗原－抗体复合物”的化学反应，以检测组织或细胞内抗原（或抗体）的技术，如PAP、ABC、SABC技术等。 英文小结 Chapter 18 The new methods of pathology In this chapter we discussed some important clinic and experimental methods of path