生化分离技术第七章_层析技术.ppt

凝胶层析的特点 ①溶质与介质不发生任何形式的相互作用。因此可采用恒定洗脱法洗脱展开，操作条件温和，产品收率可接近100％； ②每批操作结束后不需要进行介质的清洗或再生，故容易实施循环操作，提高产品纯度。 第三节 离子交换层析 离子交换层析的原理 离子交换层析(Ion exchange chromatography，IEC)是利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的不同而发生差速迁移，从而实现溶质分离的洗脱层析法 。 离子交换层析的操作 离子交换层析的装置主要包括蠕动泵、离子交换层析柱、紫外检测器及部分收集器等。进行层析时，先将树脂用展开剂处理，使树脂层析剂转变成展开剂离子的型式；然后将溶解在少量溶剂（通常为展开剂）中的试样加到层析柱的上部，再通入展开剂展开，流出液分步收集，测定其含量。 洗脱 IEC操作很少采用恒定洗脱法，而多采用流动相离子强度线性增大的线性梯度洗脱法(1inear gradient e1ution)或离子强度阶跃增大的逐次洗脱法(step wise elution)。 在线性梯度洗脱和逐次洗脱过程中，IEC柱内溶质区带后部的离子强度高于前部，因此区带后部的移动速度高于前部，溶质在洗脱过程中得到浓缩。 在实际层析操作中，如果料液组成未知，一般应首先采用线性梯度洗脱法，确定各种组分的分配特性以及层析操作的条件。 选择合适的离子交换剂是操作关键，另外离子交换层析缓冲液的选择也很重要。溶解样品的初始缓冲液离子强度要低，层析展开用的洗脱剂离子强度可升高。使用梯度洗脱时，离子强度逐渐增加。阳离子交换剂的洗脱pH由低到高，阴离子交换剂的洗脱pH由高到低。 第四节 疏水性相互作用层析 疏水性相互作用层析的原理 疏水性相互作用层析(Hydrophobic interaction chromatography，HIC)是利用表面偶联弱疏水性基团(疏水性配基)的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱层析法。 疏水性吸附剂 各种凝胶过滤介质经偶联疏水性配基后均可用作疏水性吸附剂。常用的疏水性配基主要有苯基、短链烷基(c3~c8)、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。疏水性配基与亲水性固定相粒子之间的偶联主要利用氨基或醚键结合。 疏水性相互作用层析的操作 基本操作同其它层析柱 为了有效地洗脱吸附剂上的生物大分子，可以用下列的一种或几种方法：①改换一种具有较低盐析效应的离子；②降低离子强度；③减弱洗脱剂的极性，也可加入乙二醇；④用含有表面活性剂的洗脱剂；⑤提高洗脱剂的pH。 实验结束后，吸附剂需要再生 ：用蒸馏水、乙醇、正丁醇、乙醇、蒸馏水依次洗涤，装柱，用初始缓冲液平衡吸附剂。吸附剂经再生后可反复使用。 影响疏水性吸附的因素 离子强度及种类 ：蛋白质的疏水性吸附作用随离子强度提高而增大。除离子强度外，离子的种类亦影响蛋白质的疏水性吸附。高价阴离子的盐析作用较大。疏水性吸附与盐析沉淀一样，在高价阴离子的存在下作用力较高。 破坏水化作用的物质 ：SCN-、CLO4-和I-等离子半径较大、电荷密度低的阴离子可减弱水分子之间相互作用，使疏水性吸附减弱，蛋白质易于洗脱 。 乙二醇和丙三醇等含羟基的物质也具有影响水化的作用，降低蛋白质的疏水性吸附作用 表面活性剂 ：表面活性剂可与吸附剂及蛋白质的疏水部位结合，从而减弱蛋白质的疏水性吸附。 第五节 亲和层析 亲和层析的原理 依据生物高分子物质能与相应专一配基分子可逆结合的原理，采用一定技术，把与目的产物具有特异亲和力的生物分子固定化后作为固定相，则含有目的产物的混合物（流动相）流经此固定相后，可把目的产物从混合物中分离出来，此中分离技术称为亲和层析。 亲和层析示意图 图7-13 亲和色谱分离示意图 亲和层析的操作 亲和层析包括进料吸附、清洗、洗脱和介质再生几个步骤 。 为了减小吸附操作中的非特异性吸附，所用的缓冲液的离子强度要适当，缓冲液的pH应使配基与目标产物及杂质的静电作用较小。 料液流速是影响层析速度和效果的重要因素。提高流速虽可加快分离速度，但会降低柱效。此外，琼脂糖容易受压变形，压力过大反而流速降低。 清洗操作目的是洗去介质颗粒内部和颗粒间空隙中的杂质，一般使用与吸附时相同的缓冲液 。 目标产物的洗脱方法有特异性洗脱和非特异性洗脱。 洗脱结束后，亲和柱仍需继续用洗脱剂洗涤，直到无亲和物存在为止，再用平衡缓冲液充分平衡亲和柱，以备下次使用。 特异性洗脱剂含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，洗脱目标产物。非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH、离子强度、离子