蛋白原核表达与纯化-(新生培训）-2.ppt

常见的纯化标签 标签 纯化用的填料或配基 洗脱方法 多聚组氨酸（6*His） 螯合镍、铜、钴离子的填料 咪唑或降低 pH 谷胱甘肽硫转酶（GST） 键合谷胱甘肽的亲和填料 10-20mM 还原谷胱甘肽 多聚精氨酸（Poly-Arg） SP琼脂糖凝胶 高盐 多聚半胱氨酸（Poly-Cys） 活化巯基琼脂糖凝胶 DTT 多聚苯丙氨酸（Poly-Phe） 苯基琼脂糖凝胶 乙二醇 Ni2+与组氨酸形成配位键 Ni-NTA Ni-IDA 金属螯合层析法（Metal chelate chromatography） Ni 固相载体 His His His Protein imidazole elution 价格低廉，适用范围广 常用纯化流程 样品处理 装柱，平衡 上样 洗涤与洗脱 柱子回收 M 1 2 3 4 5 6 M：Protein marker 1：空载体对照 2：包涵体 3：纯化前可溶性总蛋白 4：上柱结合后样品 5：50 mM咪唑洗脱样品 6：400 mM咪唑洗脱样品 蛋白纯化例子： 蛋白不结合 常见问题与技巧 无标签——构建有误、提前终止（C端）、二级翻译起始（N端） 测序，重新构建 标签未暴露——变性不充分，天然蛋白折叠，应充分变性 结合条件不合适——螯合剂、还原剂、咪唑、pH值……  螯合剂 EDTA≤0.1 mM（忌用） 还原剂 DTT≤1 mM（不推荐） β-ME≤20 mM（慎用） 咪唑 ≤20 mM（因蛋白而异） 洗脱条件不合适——咪唑浓度、pH值， 应梯度洗脱 非特异性结合 上调初始咪唑浓度 β-ME 非离子型去垢剂、甘油、NaCl…… 蛋白不完整——蛋白降解、提前终止（N端）、二级翻译起始（C端） 低温，蛋白酶抑制剂 重新构建 填料过多 蛋白杂带多 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M：Protein marker 1：样品裂解液 2-9：等体积梯度洗脱 蛋白纯化例子： 洗脱条件不合适——咪唑浓度、pH值 增加洗脱强度 蛋白结合能力强 上调初始咪唑浓度 蛋白浓度低 Western Blot 优化表达 蛋白未结合或被提前洗涤 电泳检查全部样品：上样前、流出、洗涤、洗脱 蛋白洗脱无检出 M 1 2 3 4 5 6 7 8 M：Protein marker 1：空载体对照 2：样品上柱前 3：样品上柱后 4：30 mM咪唑洗脱；5：100 mM咪唑洗脱 6：150 mM咪唑洗脱；7：200 mM咪唑洗脱 8：400 mM咪唑洗脱 蛋白纯化例子： Thanks for your attention! 所有B型菌株，B834，BL21，BLR，OrigamiB，Rosetta及Tuner都缺乏纯化过程中降解蛋白的lon蛋白酶及omT外膜蛋白酶。因此目的蛋白在这些菌株中的稳定性要高于带有这些蛋白酶的菌株。许多蛋白要求形成稳定的二硫键才能形成天然空间结构，没有二硫键，这些蛋白可能被降解或者形成包涵体。大肠杆菌细胞质中的氧化还原势是不能得到正确折叠的主要原因：只有转运到细胞周质空间后才能形成二硫键。带有谷胱甘肽还原酶（gor)突变和或硫氧还蛋白还原酶（trxB)突变的菌株都能增加细胞质中的二硫键形成。Origami(DE3),Origami B(DE3)和Rosetta-gami都能增加细胞质中的二硫键形成。 * * * Molecular Microbiology Food Safety Laboratory 蛋白的原核表达 与纯化策略 ZHEJIANG UNIVERSITY Cheng CY 2012-11-10 Part Ⅰ 蛋白的原核表达 Part Ⅱ 蛋白纯化 Part Ⅰ 蛋白的原核表达 1 原核表达概述 2 原核表达策略选择 3 表达结果检测 4 常见问题与实验例 大肠杆菌 (Escherichia coli) 最通用的原核表达系统 遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高； 基本不分泌，易形成包涵体(缺乏正确折叠的蛋白结构)，无蛋白加工等修饰； 常见的原核表达载体：pET系列(T7 promoter，Novagen公司)；pQE系列(T5 promoter，Qiagen公司)； pGEX系列(GST融合表达，GE公司)；pBAD系列(Arabinose诱导型) 目的基因扩增 目的基因插入表达载体 重组基因转化入宿主菌中 外源基