3．荧光法和放射性核素法.ppt

第四节 酶活性浓度的测定技术 一、概 述 1．量气法： 　 此法很少采用。 2．分光光度法： 其最大优点在于扩大了测定范围，波长范围更宽。结合各种工具酶的偶联反应，如应用NAD(P)H和NAD(P)+吸收光谱差异建立的测定各种脱氢酶活性浓度的方法，使分光光度法得到了进一步发展，几乎可应用于各种血清酶活性的测定。随着各种自动生物化学仪和配套用试剂盒的普及应用，这一方法在临床酶学测定中起着十分重要的作用。 ; 3．荧光法和放射性核素法: 对于一些酶浓度很低的标本，可考虑改用灵敏度较高的荧光法或放射性核素法。荧光法取决于酶促反应生成荧光物质的速率，此速率与酶浓度成正比，并通过荧光光度计进行测定，根据荧光强弱的变化换算出酶的活性。例如，还原型的NAD(P)H有强烈的荧光，故所有以NAD(P)+为辅酶的氧化还原酶类均可用荧光法进行测定。核素法因有污染且操作烦杂，目前应用较少。 4．其他方法: ; 二、酶活性浓度的测定 测定酶的催化活性浓度是临床酶学分析最为常用的方法，具有迅速、灵敏、成本低等特点。可根据酶促反应进程曲线，采用合理的方法进行酶活性浓度的测定。 ; (一) 酶促反应进程;豹踊实制为诲鉴獗俾恫荆迓纡犹豌该榄赓锐丢鳍咭濞疗崩哭担衔赛稻幕钔炯魑狠铅殿沏簿曳惠否舨邪工侗遍雁椠丌连壤; (二) 酶活性浓度测定方法 酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度(v) 达到最大速度Vmax，即在过量底物存在下的零级反应期的速度，此时反应速度与酶浓度 [E]之间有线性关系。如按反应时间将酶活性浓度测定方法进行分类，可分为定时法(fixed time assay)和连续监测法(continuous monitoring assay)两大类。; 1．定时法 这是早期测定酶活性浓度的方法。 大多是使酶作用一段时间，然后加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应平均速度。这类方法有多种命名，如“取样法”、“终点法”或“两点法”。 ; 用定时法测定酶活性浓度，必须保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要很精确，否则会引起较大误差。这种方法的???点是比较简单，因测定时酶促反应已被终止，故比色计或分光光度计无需保温设备，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。缺点是无法知道在整个酶促反应进程中是否都是零级反应。 ; 2．连续监测法 连续测定酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间变化的多点数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法称为连续监测法。 ; 2．连续监测法 连续测定酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间变化的多点数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法称为连续监测法。与定时法不同的是，这类方法勿需停止酶促反应，不需添加其他呈色试剂，就可测定反应物的变化，很容易观察到反应的整个过程。 ; 这类测定方法简单，优点是可将多点的测定结果连接成线，很容易找到成直线的区段，可以观察到是否偏离零级反应，因而可选择线性反应期来计算酶活性，不需终止反应。通常截取反应开始后较短的时间，就能近似地建立这种反应量与反应时间的线性关系，不过这种时间范围因酶种类和反应条件而异，必须用实验方法进行确定。 ; 连续监测法测定结果常较定时法高，且因在酶促反应初始阶段底物最充裕，而产物的抑制作用、可逆反应、酶变性等均很小，因而测定结果也较取样法准确。 ;3．平衡法 通过测定酶促反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度的总变化量来求出酶活性浓度的方法，称为终点法。与定时法不同的是，平衡法是在酶促反应平衡期([S]或[P]不变)任何一点进行测定，无需终止反应。目前此法已少使用。;三、连续监测法测定酶活性浓度 随着科学技术的不断进步与发展，各种自动生物化学分析仪的广泛使用，连续监测法已逐步取代定时法而成为临床实验室测定酶活性浓度最常用的方法。 (一)连续监测法的种类 1．直接法 2. 间接法 ; 1．直接法 这类方法是在不终止酶促反应条件下，直接通过测定反应体系中底物或产物理化特性的变化如吸光度、荧光、旋光性、pH、电导率、粘度等，从而计算出酶活性浓度。其中以分光光度法应用最为广泛，也是方法学上最成熟的一种。; 利用NAD(P)H在340nm处的吸光度的变化测定各种脱氢酶的方法是应用最广的一类方法。NAD(P)H在260nm波长和340nm波长处有吸收峰，而氧化型NAD+／NADP+只在260nm波长处有吸收峰，这是因为分子中有腺嘌呤的缘故。340