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高通量棉花DNA的快速提取 姓名：毕慧芳 班级：农学072 学号：073131236 指导教师：高文伟 实验材料,设备 棉花叶片均来自新疆农业大学农学院作物遗传育种教研室。 高速冷冻离心机(eppendorf)、紫外分光光度计(UV-754N)、电泳仪为DYY-6C型、，恒温水浴锅，PCR仪为BIO-RAD公司型MyCycle，冰箱。电泳槽为DYCZ-30型、DYCZ-20D型从北京六一公司购进，摇床为WD-9405B、HY-2型。电子天平。 试验方法 SDS法 SDS(十二烷基硫酸钠)是一种阴离子去污剂,可使蛋白质分子中的二硫键还原.此方法是用在提取DNA时通常采用酚和氯仿来处理DNA 的纯化过程，在后来的改进后用氯仿异戊醇来代替了酚、氯仿，因为酚在1小时内可降解1μg已纯化好的DNA，在提取好的DNA被酶切使待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染,以免干扰酶的活性，所以使用了氯仿异无醇，主要目的就是去除变性的蛋白，在试验过程中避免酶切后给试验带来的不便。 改良的DNA提取方法 (1)把SDS放入温度在60摄氏度的水浴锅中预热30分钟；(2)开始对棉花叶片（0.2-0.5g）进行研磨，将研磨好的叶片中加入500毫升SDS提取液后，移入离心管中，在65℃的水浴锅中放置30分钟；(3)取出后冷却后加 600毫升氯仿异戊醇后，轻摇，在转速为12000转的离心机中离心4分钟；(4)取出上清加600毫升氯仿异戊醇，轻摇，离心10000转2分钟；(5)取出上清，加适量的无水乙醇，待呈现白色絮状物后，离心10000转2分钟，去上清；(6)用70%的乙醇洗2次，晾干；(7)加TE200ul放入冰箱备用。 所提DNA用作PCR反应 反应体系　 总体积25 ul。其中Buffer 2.5 ul, dNTP 0.5 ul, MgCl22 ul, TaqDNA聚合酶0·2 ul,引物3ul, DNA模板3 ul,灭菌蒸馏水加至25 ul 反应条件 在94℃下预变性5分钟;然后94℃变性1分钟、55℃复性1分钟、72℃延伸1分钟, 35循环;最后72℃延伸7分钟。 聚丙烯酰胺凝胶过程 (l)洗净玻璃板:擦洗新玻璃板。直到表面干净没有杂质、不挂水取板时应握住板的边缘，避免手上的油脂印在玻璃板的工作面上。 (2) 制胶：按比例控制工作液，混匀，灌入玻璃板之间的空隙达到适当的高度时，注意尽量消除胶表面的曲度，使凝胶表面平坦，并立即插入样品口模板，注意观察凝胶的聚合过程。 (3) 上样：将聚合的凝胶板装入电泳槽，加入点用缓冲液，拔下上样梳，准备上样。 (4)电泳：上样后，接好电源线，开始电泳，待染料下行到距胶末端0.5～1cm,即可停止电泳。 （5）剥胶 电泳结束后，从电泳装置上卸下制胶模具，剥胶是注意不要损伤凝胶表面。 改良的SDS法提取液用量的确定 讨论 讨 论 材料的选择与储存 新鲜和幼嫩的棉花叶片含有较完整的DNA,常用来制备高质量的基因组DNA。老化或储存时间较长的材料中,多糖、单宁等次生代谢物质含量高,在提取过程中会与DNA结合,并且难以去除,严重影响DNA的获得率和质量。用70%的乙醇清洗表面或浸泡1 min,避免外源DNA污染,然后用无菌的去离子水冲洗材料,备用。用这样处理后的材料提取到的DNA完整性好,纯度高。 操作步骤 实验中使用的移液尖头应剪去前端,以保证DNA的完整性和获得率。细胞裂解后的实验操作,要在低温条件下进行,操作应温和,以保证DNA完整性。SDS和CTAB都是一类去污剂,其作用是破坏细胞膜释放DNA,此外与提取缓冲液中的EDTA一起,共同保护DNA免受内源核酸酶的降解。本实验由于重复次数少，因此结果有些误差，这可能是因为人为操作原因。可在以后的试验中继续检验。 从紫外分光光度计法和凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度结果看, 改良SDS法提取DNA浓度较大，纯度较好；SDS法提取的DNA浓度大,纯度较好, CTAB法所提取的DNA有少量降解,实验中采用的改良的SDS提取方法不同程度避免使用有害溶剂—苯酚等,减轻对人体的危害。 改良SDS法提取DNA采用的步骤少,时间短;浓度大,纯度较好,在仅需要棉花总DNA时,是一种可以选用的方法。 实验过程与康传红方法相比有以下几个方面优点。首先提取过程以氯仿异戊醇抽提,而不用苯酚,减轻对人体的伤害。不用Rnase,减少实验步骤,缩短了时间,降低DNA的损失,可能与取消KAc冰浴有关，但试