核酸杂总12.10.pptVIP

核 酸 杂 交 目的与要求 了解核酸变性、复性和杂交的基本概念 了解核酸探针的概念、种类及选择原则 了解核酸探针的标记和检测方法 了解常用核酸杂交的方法及应用 DNA双螺旋模型 1953年Watson 及Crick在化学分析及X光衍射法观察DNA结构的基础上提出了著名的DNA双螺旋结构模型（double helix model） DNA双螺旋结构特点 （1）两条链以一共同轴为中心，成右手双螺旋。螺旋直径2nm。形成链间的两种沟，即大沟与小沟。 （2）两条链构成反平行排列的双螺旋。 （3）两条链借氢键连系在一起。A、T间有两个，G、C之间有三个氢键。配对的碱基处于同一平面，与双螺旋的中心轴垂直，两条链彼此称为互补链。 （4）碱基对之间氢键的能量为3～7kcal/mol，维系DNA双链结构。相邻碱基对间有范德瓦士力作用（此力为1～2kcal/mol,作用范围为0.5nm），能量虽弱但由于碱基对多，合力也就大。可见碱基对的氢键及碱基对之间的范德瓦士力是稳定DNA成双螺旋结构的主要能量。 DNA的变性 DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成单链无规则线团，因而发生性质改变（如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等），称为DNA变性。 加热、改变DNA溶液的pH、或受有机溶剂（如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等）等理化因素的影响，均可使DNA变性。 DNA变性 在波长260nm处紫外吸收的变化：DNA在260nm处有最大吸收值是由碱基决定的，在DNA双螺旋结构模型中碱基藏于内侧，变性时由于双螺旋解开，碱基外露，260nm紫外吸收值因而增加，这一现象称为增色效应（hyperchromic effect） DNA 的变性 DNA的加热变性 升高温度使DNA变性，以温度对紫外吸收作图，可得到一条曲线，称为熔解曲线，当温度升高到一定范围时，DNA溶液在260nm处的吸光度突然明显上升至最高值，随后即使温度继续升高，其吸光度也无明显变化。由此说明DNA变性是在一个很窄的温度范围内发生，增色效应是爆发式的。从而也说明当达到一定温度时，DNA双螺旋几乎是同时解开的。通常人们把50%DNA分子发生变性的温度称为变性温度（即熔解曲线中点对应的温度），由于这一现象和结晶的融解相类似，故又称融点或融解温度（melting temperature, Tm）。因此Tm是指消光值上升到最大消光值一半时的温度。 DNA热变性时：Tm值 DNA的Tm值与以下因素有关 （1）DNA的均一性：均一DNA如病毒DNA，解链发生在很窄的范围内，而不均一的DNA如动物细胞DNA其Tm值的范围则较宽。 （2）DNA分子中（G+C）的含量：一定条件下DNA的Tm值，由G+C含量所决定，因为G+C之间有3个氢链，因此G+C含量较高的DNA，Tm值较高，二者的关系在一定离子强度下可用经验式表示：Tm=69.3+0.41(G+C)% （3）溶剂的性质：Tm不仅与DNA本身性质有关，而且与溶液的条件有关，通常溶液的离子强度较低时，Tm值较低，融点范围也较宽；离子强度增高时，Tm值升高，融点范围也变窄。 DNA的复性（退火） 变性DNA只要消除变性条件，二条互补链还可以重新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性（renaturation）。通常DNA热变性后，将温度缓慢冷却，并维持在比Tm低25～30℃左右时，变性后的单链DNA即可恢复双螺旋结构，这一过程又叫做退火。复性后的DNA，理化性质都能得到恢复。倘若DNA热变后快速冷却，则不能复性 热变性过程和两种冷却过程 影响DNA复性的因素 DNA的复杂程度: DNA序列简单的分子复性很快。 DNA片段的大小也影响变性的速率。同样条件下，同一种DNA浓度愈高，复性速度也愈快。 溶液的离子强度对复性速度也有影响，通常盐浓度较高时，复性速度较快。 DNA内很少片段有重复的或很相似的碱基顺序（所谓重复DNA）。DNA复性的程度和过程与其信息含量的多少等有关 DNA复性曲线呈S形，随着信息含量增加，此形状相同曲线往往较高Co.t值处移动。 核酸分子杂交 核酸分子杂交的基础：分子单链之间的互补碱基通过之间非共价键（主要是氢键）的形成即出现稳定的双链区。 杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补。 分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间进行。 DNA与DNA杂交：一般DNA以双链存在，在进行杂交时，先将其解聚成为单链（变性）。再退火使单链聚合成双链。 定性或定量分析分子杂交：将一种核酸单链用同位素或非同位素标记成为探针，再与另一种核酸单链进行分子杂交。 核酸分子杂交的发展 液相杂交：Hall等1961年将探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体。该法很慢、费力