单个植入前胚胎mRNA差异显示方的建立(.docVIP

欢迎光临fangsheke66豆丁文档单个植入前胚胎mRNA差异显示方法的建立? 郁卫东 杨立新 李文雍 刘桂生 陈清轩** （中国科学院遗传和发育生物学研究所 中国科学院研究生院 北京 100080） 摘要 在已有的研究基础上，优化和建立了单个植入前胚胎的mRNA差异显示（Single Preimplantation Embryo Differential Display Polymerase Chain Raction,SPEDD-RTPCR） 方法.以小鼠单个成熟的卵母细胞和单个的2-细胞期胚胎作为起始材料,比较二者之间基因的表达差异。选择在卵母细胞中不表达而在2-细胞期表达的差异片段。进行Genbank检索和EST库computer cloning，用与多胚研究结果一致、由线粒体编码的和2细胞特异表达的NADH脱氢酶亚单位2和ATPase 6证实了SPEDD-RTPCR方法是可行而且可靠的，是一种需要材料极少、应用广泛而有效的基因分离方法。 关键词 植入前胚胎，早期胚胎发育，单胚胎mRNA差异显示， 缺乏足够的实验材料和有效的实验技术一直是阻碍研究哺乳动物植入前胚胎发育的主要因素。目前，mRNA差异显示(mRNA Differential Display Polymerase Chain Raction , DDDRT-PCR)是识别和分离发育相关基因的主要技术。[1,2] 1992年Liang等人建立的mRNA差异显示方法，在生物医学等诸多领域得到了广泛的应用，发现了许多新的差别表达基因[2]。1994年James和 Richard首先利用DDRT-PCR对小鼠早期植入前胚胎的基因表达进行了研究，之后，相关的文献逐渐增多，技术上也取得了一定的进展[3-11]。目前对逆转录之前的核糖核酸的处理基本有两种办法：一种需要先提取总RNA，然后进行逆转录；而另一类则不需提取总RNA就可直接进行逆转录。前者存在着需要材料多（≥50枚）和胚胎不同步发育的缺点，而后者虽然将使用的起始材料降为了10枚，但依然存在不同步发育的问题[6]。 植入前胚胎的基因表达研究需要对基因表达的时空模式进行精确的定性和定量，而且对于象人类植入前胚胎或者特殊处理的哺乳动物重构胚胎这样的珍稀材料，往往只能用更少的乃至一个胚胎来进行研究[12]。为此，我们在已有的研究基础上对早期植入前胚胎的mRNA差异显示方法进行了改进，建立了单个植入前胚胎的mRNA差异显示方法.该方法不仅能够准确而稳定地反应出早期植入前胚胎发育过程中特异性基因的表达模式，而且能够达到或超过多胚胎差异显示的效果。该方法的建立为研究哺乳动物正常植入前胚胎的基因表达以及克隆胚胎再程序化相关基因的表达奠定了基础，是发现发育相关基因和再程序化过程中特异表达基因的有效方法[13]。 材料和方法 1 .1材料 6-8周龄的雌性昆明白小鼠由中国科学院遗传与发育生物学研究所实验动物中心提供； PMSG由天津市华孚高新生物技术公司生产； hCG由上海第一生化药业公司生产；透明质酸酶、NP-40 和dNTPs购自Sigma公司；M-MLV逆转录酶购自Gibco公司； AMV逆转录酶购自Roche公司；Primer RNase 抑制剂购自Eppendorff公司；,RNase Guard 购自Amersham Pharmacia Biotech； Taq DNA 聚合酶、pGEM-T 载体、X-Gal和IPTG购自Promega公司；所用 3ˊ引物 HT（15）G 5ˊ-AAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTG-3ˊ和 5ˊ引物HAP1 5ˊ-AAGCTTGATTGCC-3ˊ由上海生工生物工程公司合成； [α-32P]dATP、[α-32P]dCTP（比活性3000X3。7X1010Bp/mmol）购自北京亚辉公司；随机引物标记盒购自TaKaRa公司；其他试剂国产分析纯产品。 1.2 方法 1.2.1 超排MⅡ卵和2细胞受精卵的获得 采用Capco 的方法分别给6-8周龄的雌性昆明白小鼠注射PMSG及hCG，获取MⅡ卵母细胞和2细胞胚胎[14]。MⅡ卵母细胞经0.5%的透明质酸酶去除卵丘细胞后，与2-细胞胚胎一样用酸性台氏液（pH2.0-2.5）去除透明带，PBS清洗后立即进行RT-PCR反应。 1.2.2 RT-PCR反应体系的建立 逆转录体系含有1 X逆转录缓冲液；20mM DTT ;0.5%NP-40;20μM dNTPs ; 4 μM HT（15）G Anchor Primer;0.25μl RNase 抑制剂和RNase Guard mix; 加入无RNase-DNase 水至4.5 μl（以20μl逆转录体系为例需要：5X逆转录缓冲液 4μl，10% NP-40 1μl，