乙型肝炎的原学诊断.pptVIP

分子生物学实验 一、实验目的 1、熟悉乙肝病毒DNA提取方法 2、掌握乙肝病毒DNAPCR检测方法 二、实验原理 聚合酶链反应（PCR）技术是在体外模拟体内DNA复制，利用两段特异的寡核酸引物，由DNA聚合酶催化产生目的基因的扩增技术。 PCR技术基本原理 目的基因扩增 三、实验准备 （一）试剂 1、DNA提取液 2、PCR反应液 3、石蜡油、双蒸水 4、电泳缓冲液（TAE） 5、2％琼酯糖 6、溴化乙锭（EB） 7、Taq聚合酶 三、实验准备 （一）器材和仪器 1、离心机 2、水浴锅 3、PCR扩增仪 4、电泳槽、电泳仪 5、紫外灯 6、移液器 三、实验步骤 （一）乙肝病毒DNA提取（热裂解法） 1、分离血清 2、50ul血清加入50 ul裂解液混匀。 3、沸水浴煮10分钟。 4、15000转离心15分钟。 5、取上清到另一离心管中备用。 三、实验步骤 （二）HBV－DNA扩增 1、配制反应液（15ul10×TAE，1ulTaq酶，13ul双蒸水，1ul模板）,振荡混匀. 2、扩增仪中：94℃30秒，55℃30秒，72 ℃1分钟，共30循环。 3、72 ℃延伸5分钟。 三、实验步骤 （三）扩增产物检测 1、配制2％琼酯糖的凝胶 2、取扩增产物10ul加入凝胶小孔中 3、电泳30分钟 4、紫外灯下观察结果。 四、注意事项 1．分区操作：PCR具有超敏感性，因此在检测过程中应分区