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杀菌和抑菌试验 制作人：质量人 一、总则 适用范围：本方法适用于医疗、卫生、食品等行业的杀菌和抑菌试验。 引用标准：消毒技术规范2002 二、术语 消毒 disinfection 杀灭或清除传播媒介上病原微生物,使其达到无害化的处理。 灭菌 sterilization 杀灭或清除传播媒介上一切微生物的处理。 消毒剂 disinfectant 用于杀灭传播媒介上的微生物使其达消毒或灭菌要求的制剂。 灭菌剂 sterilant 可杀灭一切微生物(包括细菌芽孢)使其达到灭菌要求的制剂。 二、术语 杀灭时间 killing time, KT 用于生物指示物抗力鉴定时, 指受试指示物样本，经杀菌因子作用不同时间后, 培养后的全部样本均无菌生长的最短作用时间 (min) 杀灭率 killing rate, KR 在微生物杀灭试验中，用百分率表示微生物数量减少的值，以其表达杀灭效果。 灭对数值 killing log value 微生物数量以对数表示时，消毒后与消毒前比较, 以其减少的对数值来表达杀灭效果。   三、菌悬液与菌片的制备 （一）、试验前应选择合适的细菌，在下述规定中表中‘+’为必做试验 的微生物 ，根据消毒剂特定用途或试验特殊需要，还可增选其他菌株。 三、菌悬液菌片的制备 （二）、试验器械 A.无菌蒸馏水 B.细菌培养基：胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA），胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）和营养肉汤培养基等 C.刻度吸管（1.0ml、5.0ml、10.0ml），毛细吸管。 D.数字可调移液器（10μl~200μl）及配套用一次性塑料吸头。 E.浊度计。 F. 游标卡尺。 三、菌悬液菌片的制备 （三）、细菌繁殖体悬液的制备 1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0 ml～10.0ml 营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置 37 ℃ 培养18h～24h。 用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于 37℃ 培养 18h～24h。挑取上述第 2 代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于 37℃ 培养 18h～24h，即为第3 代培养物。 2）取菌种第 3代～14 代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h～24h），用 5.0ml 吸管吸取 3.0 ml～5.0ml 稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用 三、菌悬液菌片的制备 5.0ml 吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合（振荡）20s，或在手掌上振敲 80 次，以使细菌悬浮均匀。 3）初步制成的菌悬液，先用细菌浓度比浊测定法粗测其含菌浓度，然后以稀释液稀释至所需使用的浓度。 4）细菌繁殖体悬液应保存在 4℃ 冰箱内备用。应当天使用不得过夜。 5）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。 四、菌片的制备程序 1）滴染法染菌时，先用浊度计测定的菌悬液浓度，调 至含菌量为1～5×108cfu/ml将经灭菌的载体片平铺于 无菌平皿内，菌液滴加量每片为10μl。用10μl移液器 接灭菌塑料吸头，滴染菌液，并用接种环涂匀整个载体 表面。滴染菌液后，染菌载体可置37℃温箱内烤干（约20min～30min），或置室温下自然阴干后再使用。 2）每个菌片的染菌量，即回收菌数，按活菌培养计数所得结果，应为 5×105 cfu/片～5×106 cfu/片。 3）配制菌悬液和制备菌片时，保持环境的洁净和安静，严格按无菌要求操作，以防污染杂菌，影响随后杀菌试验的结果。 五、活菌培养计数技术 1） 取含 5.0ml 稀释液无菌试管，对菌片或小型固 体样本直接投入即可，对棉拭则将其采样端剪入管内，每管一份样本。而后，用手掌上用力振敲 80 次，形成菌悬液。 2）将试管按需要数量分组排列于试管架上， 每管加入 4.5ml 稀释液。各组由左向右，逐管标上 10-1、10-2、10-3......等。 3）将菌悬液样本在手掌上用力振敲 80次，吸取 0.5ml加至 10-1 管内。 4）将 10-1 管依前法在手掌上用力振敲 80次，混匀，再吸取出 0.5ml 加入10-2 管内。如此类推，直至最后一管。 五、活菌培养计数技术 5）选择