Caco―2细胞研究黄芪中活性成分毛蕊异黄酮吸收转运.docVIP

Caco―2细胞研究黄芪中活性成分毛蕊异黄酮吸收转运 　　[摘要]黄酮类成分是中药中一类重要的活性成分，其药理活性和体内过程是近些年研究的重点。毛蕊异黄酮是中药黄芪中黄酮类的主要活性成分，近些年的研究表明其具有多种药理活性，但在体内的吸收转运特性尚不明确。该实验运用Caco-2细胞模型， 用芹菜素作为内标物质，采用高效液相法测定药物浓度的方法，分别研究不同浓度以及加入不同类型的蛋白抑制剂后的吸收转运特性。数据进行Q检验，结果表明毛蕊异黄酮低、中、高3种浓度的Papp（BL-AP）/Papp（AP-BL） =1.38　　[关键词]Caco-2细胞；毛蕊异黄酮；吸收；转运 　　黄芪为一味常见中药，具有补气升阳，固表止汗，利水消肿，生津养血，行滞通痹，托毒排脓，敛疮生肌。近些年来其黄酮类的活性研究较多，毛蕊异黄酮为黄芪中黄酮类的主要活性成分，相对分子质量中等，脂溶性较好。已有较多文献报道，毛蕊异黄酮具有抗疟原虫的活性[1]、保护血管内皮细胞[2]、抗高血压[3]、抗高血糖[4-5]、神经保护作用[6-8]、皮肤美白剂[9]、增强造血功能[10]、雌激素[11]和治疗白血病[12-13]等多种生物活性。关于毛蕊异黄酮的研究报道主要集中在药理、药效方面，关于其吸收方面的研究较少。本文通过Caco-2细胞模型来研究毛蕊异黄酮的吸收转运情况，为其开发利用及其药对配伍的合理性奠定基础。 　　1材料 　　1.1仪器 　　美国waters e2695高效液相色谱系统；二氧化碳培养箱（Hearous，德国）；XDS-1B倒置显微镜（重庆）；Millcell-ERS跨膜电阻仪（Millipore，美国）；Transwell培养板（NUNC，丹麦）；高速冷冻离心机（Beckman，美国）；Milli-Q纯水机（Millipore，美国）；FA1204B电子分析天平（上海精密科学有限公司）；HH-2K2恒温水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）；pHS-3C型pH计（上海精密科学仪器厂）。 　　1.2细胞 　　Caco-2 TC7细胞株，由法国Moniqué Rousse博士馈赠。 　　1.3药品与试剂 　　毛蕊异黄酮对照品（四川维克奇生物制品公司，批号120510，纯度98.0%），芹菜素对照品（中国食品药品检定研究院，批号111901-201102，供含量测定用）。乙腈、甲酸（色谱纯，Merck公司），水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。 　　2方法 　　2.1HPLC的分析方法 　　2.1.1 色谱条件 Thermo C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈-0.1%甲酸水（45∶55）；流速1.0 mL?min-1；检测波长258 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。 　　2.1.2 溶液配制 毛蕊异黄酮储备液的配制：精密称取一定量的毛蕊异黄酮20.13 mg，至10 mL量瓶中， 用乙醇定容，得到7 081.54 μmol?L-1储备液。 　　芹菜素储备液的配制：精密称取一定量的毛蕊异黄酮1.30 mg，至10 mL量瓶中，用乙醇定容，得到浓度为481.05 μmol?L-1储备液。 　　2.1.3 细胞样品处理 吸取细胞上清液100 μL，加入192.42 μmol?L-1芹菜素溶液25 μL，涡旋2 min，14 000 r?min-1离心10 min，取上清，进样测定。 　　2.2方法学考察 　　2.2.1 方法专属性考察 按照2.1.1项下的色谱条件，样品、内标分别与对照品在相应位置上有相似吸收峰，而空白溶液则无，表明杂志对测定无干扰。见图1。 　　2.2.2 标准曲线的制备 精密吸取毛蕊异黄酮储备液，用空白HBSS缓冲液稀释，分别制成浓度为1.25，2.5，5，10，20，40，80 μmol?L-1，按2.1.3方法处理后进样，记录峰面积，以HBSS缓冲液中毛蕊异黄酮的浓度（X）对毛蕊异黄酮与内标芹菜素峰面积的比值（Y）进行线性回归。 　　2.2.3 毛蕊异黄酮在不同pH HBSS缓冲液中稳定性考察 采用盐酸和NaOH溶液调节HBSS缓冲液，用pH计测定pH，分别为6.05，7.45，8.02，配制毛蕊异黄酮低、中、高3个浓度（2.5，10，40 μmol?L-1）的供试液。37 ℃水浴条件下放置，分别于0，4 h取样，测定毛蕊异黄酮的含量，计算降解残存百分率。 　　2.2.4 批内和批间精密度考察 精密吸取毛蕊异黄酮储备液，用空白HBSS缓冲液稀释，配制毛蕊异黄酮低、中、高3个浓度（2.5，10，40 μmol?L-1）的供试液，按2.1.3方法处理后分别进样，测定毛蕊异黄酮的含量，计算降解残存百分率。 　　2.2.5 绝对回收率考察 精密吸取毛蕊异黄酮储备液，用空白HBSS缓冲液稀释，配制毛蕊异黄酮低、中