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不同花生品种对卡那霉素敏感性研究 　　摘 要： 　　以花生胚小叶为外植体，观察花生胚小叶在添加不同浓度卡那霉素的分化培养基上的生长状况，研究不同花生品种对卡那霉素的敏感性，以确定各品种的卡那霉素临界浓度。结果表明，在供试品种中，D16对卡那霉素最敏感，其临界浓度为100 mg/L；花育22对卡那霉素的耐受性最高，其临界浓度为200 mg/L；J11及鲁花11的卡那霉素临界浓度均为150 mg/L。 　　关键词：花生；胚小叶；卡那霉素；敏感性；临界值 　　中图分类号：S565.203.53 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）04-0036-03 　　生 （Arachis hypogaea L.）是世界四大油料作物之一，在我国经济发展中占有重要地位，是我国重要的经济和油料作物[1]。近几年随着花生离体培养的快速发展，花生遗传转化也飞速发展着，农杆菌介导是花生遗传转化最常用的方法[2～4]。在转基因植株的初步检测中，抗生素筛选是最为常用的方法[5～10]，其中卡那霉素最为常用[4，6～16]。卡那霉素（Kanamycin，简称Km）能强烈抑制细胞生长，能够使多种植物绿色器官黄化；低浓度卡那霉素能够抑制植物细胞分化，高浓度卡那霉素则能够导致植物死亡[1，5，6，12，13]。在转基因植物筛选中，常用抗性基因作为标记基因[7，11，17]，NPTⅡ、HPT、CAT、SPT、Gent等是使用最多的抗生素抗性酶基因[18]。NPTⅡ（新霉素磷酸转移酶）基因是目前植物遗传转化中常用的标记基因，含有该基因的植物能够对卡那霉素产生抗性，从而存活下来[11，17，21]。 　　不同花生品种对卡那霉素的敏感程度不同，单世华等[1]对泉花10号和金花1012的带胚单子叶进行研究，得到的卡那霉素临界浓度为200 mg/L；庄振宏等[19]研究得到泉花10号花生小叶的临界卡那霉素浓度为150 mg/L；胡晓君等[20]的试验结果则表明，花生离体叶片的卡那霉素筛选浓度为400 mg/L，不同苗龄叶片对卡那霉素的敏感性不同。本试验研究了4个不同花生品种胚小叶对卡那霉素的敏感性，以期得到各品种的卡那霉素临界浓度，为其遗传转化奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　花生品种J11、花育22号、D16、鲁花11号，均由山东省花生研究所提供。 　　1.2 试剂 　　卡那霉素，购于上海生工；MS基本培养基（添加适量NAA、6-BA）、分化培养基、75%乙醇、0.1%升汞，所用药品或试剂均为国产分析纯。 　　1.3 主要仪器设备 　　高温高压蒸汽灭菌锅，江南仪器厂；人工气候箱，宁波江南仪器厂；微量移液器，Enpendorf，德国；AA-680型原子吸收分光光度计，日本岛津；J-20XP高速冷冻离心机，美国BECKMAN公司；PB303-N电子精密天平，梅特勒-托利多公司；79HW-1恒温磁力搅拌器，江苏省金坛市荣华仪器厂；PHS-3 pH计，上海精密仪器有限公司；超纯水系统，Millipore，美国。 　　1.4 试验方法 　　1.4.1 种子消毒 选取成熟饱满、活力高的花生种子，用自来水冲洗2～3次；在超净工作台上用75%乙醇消毒3次，1 min/次；然后用0.1%升汞浸泡10 min；再用无菌水漂洗3～4次，1 min/次，然后于无菌水中浸泡2～4 h。 　　1.4.2 外植体获得 在超净工作台上剥去消毒处理后的种子种皮，接种于MS基本培养基上，培养4～6 d后，切取花生胚小叶作为外植体。 　　1.4.3 敏感性试验 设卡那霉素浓度梯度：0、50、100、150、200 mg/L，在培养基高温高压灭菌并冷至65℃左右时加入。切取生长状况良好的胚小叶，接种于添加不同浓度卡那霉素的分化培养基上，培养3周后统计各品种外植体的白化率和出愈率。 　　白化率（%）=白化外植体数/接种总外植体数×100 　　出愈率（%）=产生愈伤组织外植体数/接种总外植体数×100 　　2 结果与分析 　　2.1 卡那霉素对不同品种花生出愈率的影响 　　由图1可以看出，Km浓度越高，出愈率越低；0、50 mg/L时，4个品种均能够产生愈伤组织；100 mg/L时，D16的出愈率为零，说明与其他3个品种相比，D16对Km最为敏感；当Km浓度达到150 mg/L时，只有花育22号还有愈伤组织产生，出愈率为10%，说明4个品种中，花育22号对Km最不敏感；但当Km浓度达到200 mg/L时，4个品种均不产生愈伤组织。 　　图1 各品种在不同Km浓度下的出愈率 　　2.2 卡那霉素对不同品种花生白化率的影响 　　由图2可以看出，在未添加Km的培养基上，各品种均无白化植株出现；Km浓度为50 mg/L时，花育22号仍无明显的白化株出现，而其他3个品种的白化率均超过了10