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CIK细胞不同培养时间生物学活性 　　[摘要] 目的 探讨CIK细胞培养时间与细胞毒活性的关系。 方法 抽取恶性肿瘤患者的外周血分离单个核细胞（PBMC），用细胞因子诱导培养CIK细胞，于培养第0、7、14、21、28、35、42天分别收取培养的CIK细胞。用流式细胞仪分析检测CIK细胞中CD3+、CD56+双阳性细胞的百分率及增值率，用MTT法测定其对肺癌细胞株A549杀伤活性。 结果 培养第21天细胞扩增倍数为（372±1.87）倍，培养第28天细胞扩增倍数为（410±6.52）倍，两者比较差异有统计学意义（P 　　[关键词] CIK细胞；细胞毒活性；增殖率；表型 　　[中图分类号] R-331 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）01（a）-0012-03 　　肿瘤的生物免疫治疗作为第四种治疗手段日益受到重视[1]。细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer cell，CIK）是肿瘤生物免疫治疗的主力军[2]。其主要的效应细胞为CD3+、CD56+表型T淋巴细胞，因此，培养高纯度CD3+、CD56+细胞是提高CIK细胞毒活性，增强对肿瘤细胞杀伤的关键[3]。本研究通过体外的CIK细胞毒实验及流式细胞仪分析检测CD3+、CD56+双阳性细胞的百分率，观察不同培养时间CIK细胞的增殖能力、杀伤活性，以探讨CIK细胞培养时间与细胞毒活性的关系。 　　1 资料与方法 　　1.1 主要试剂 　　人淋巴细胞分离液Ficoll Paque Plus，基因重组人IL-2、IL-1、IFN-γ和CD3单抗（Sigma公司），RPMI1640培养基（美国GIBCO），小牛血清（NCS）（美国GIBCO），四甲基偶氮唑盐MTT（华美公司），二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司，美国）。流式试剂CD3FITC/CD56PE（BD公司，美国），肺癌细胞株A549均为本实验室保存和传代培养。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 CIK细胞的培养 抽取恶性肿瘤患者的外周血，Ficoll密度梯度离心分离单个核细胞（PBMC），用RPMI1640调整至2×106个/mL进行培养，培养基中含10%小牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、1×105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素和50 μmol/L、巯基乙醇、IFN-γ 1 000 U/mL，于当日加入IFN-γ（1 000 μ/mL），置于37℃和体积分数为5%的CO2培养箱中培养24 h，第1天加入IL-2（1 000 U/mL）、IL-1α（100 μ/mL）、McAb（50 μg /mL），以后每3天换液1次，培养42 d，于培养第0、7、14、21、28、35、42天分别收取培养的CIK细胞。 　　1.2.2 CIK细胞扩增分析 在培养扩增后第7、14、21、28、35、42天分别收取培养的CIK细胞制成细胞悬液，用台盼蓝排除法计数活细胞，并除以初始细胞数，求出实际扩增倍数。 　　1.2.3 CIK细胞的表型分析 分别收取培养第0、7、14、21、28、35、42天CIK细胞，用PBS洗2遍，重悬后分别加入1.5 mL管中，每管106个细胞，离心后，加FITC标记的抗CD3mAb和PE标记的抗CD56mAb各50 μL，于4℃孵育30 min。PBS洗2遍，离心后，每管加1 mL FACS保存液。用流式细胞仪分析CIK细胞的表型。 　　1.2.4 CIK细胞体外细胞毒活性检测 采用96孔培养板用MTT法测定CIK细胞的杀伤活性，收取第0、7、14、21、28、35、42天培养的CIK作为效应细胞，肺癌细胞株A549细胞作为靶细胞，取对数生长期A549细胞调整浓度为1×105个/mL，CIK细胞浓度分别调整为1×106/mL、2×106/mL、4×106个/mL，效靶比依次为10∶1、20∶1、40∶1，分为实验组、效应细胞组、靶细胞组，每组3个复孔，实验组每孔加效应细胞、靶细胞各100 μL，靶细胞组每孔加入靶细胞、1640培养液各100 μL，效应细胞组每孔加入效应细胞、1640培养液各100 μL，置37℃，5%CO2培养箱中培养40 h，加入MTT试剂每孔100 μL，37℃孵育4 h，弃去上清，每孔加入DMSO溶液100 μL，震荡溶解沉淀后于全自动酶标检测仪（波长571 nm）检测吸光度值（A值）计算杀伤率，杀伤率=[1-（实验孔A值-效应孔A值/靶细胞孔A值] ×100%。 　　1.3 统计学方法 　　应用SPSS 17.0软件包进行统计学处理，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用百分率表示，组间对比采用χ2检验。以P 　　2.2 用流式细胞仪分析不同培养时间CIK细胞的表型变化