蛋白酶活性地测定.docVIP

华南农业大学综合实验报告实验项目名称：酶活力测定实验项目性质：综合实验计 划 学 时 ：所属课程名称：食品与发酵工业分析实验完成时间：2013.05.10糖化酶活力测定（直接滴定法）1、原理采用可溶性淀粉为底物，在一定的pH值与温度下，使之水解为葡萄糖 (还原糖)，以直接滴定法测定。 2、试剂及仪器（1） 碱性酒石酸铜钾溶液（使用时等体积混合甲、乙溶液）： 甲液：称取15.693g硫酸铜(Cu2SO4·5H2O)，0.05g次甲基蓝，用水溶解并稀释定容至1000mL； 乙液：称取50g酒石酸钠钾，54g氢氧化钠，4g亚铁氰化钾，用水溶解并稀释定容至1000mL （2） 0.1%标准葡萄糖溶液：准确称取1g无水葡萄糖（预先在100-1050C烘干），用水溶解，加5mL浓盐酸，用水定容至1000mL。 （3） pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲溶液： 0.2mol/L乙酸溶液：量取11.8mL冰乙酸，用水稀释至1000mL； 0.2mol/L 乙酸钠溶液：称取27.2g乙酸钠（CH3COONa·3H2O），用水定容至1000mL；pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲液：取0.2mol/L的乙酸溶液和0.2mol/L的乙酸钠溶液等体积混合。 （4） 0.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，用水溶解并定容至1000mL。 （5） 2%可溶性淀粉溶液：准确称取2g可溶性淀粉（预先于10-105 0C烘干），加少量水调匀，倾入80mL沸水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100mL。 （6） 固体曲 （7） 滴定管、电子天平、烧杯、恒温水浴锅、脱脂棉、容量瓶、移液管、三角瓶 3、测定步骤（1） 5%固体曲浸出液制备：称取5.0g固体曲（以绝干曲计），置于250mL烧杯中，加90mL水和10mL pH4.6乙酸－乙酸钠缓冲溶液，搅匀，于30℃水浴中保温浸1小时，每隔15min搅拌一次。用脱脂棉过滤，滤液为5％固体曲浸出液。 （2）固体曲糖化液的制备：吸取25mL 2％可溶性淀粉溶液，置于50mL容量瓶中，于30℃水浴预热10min。准确加入5mL 5％固体曲浸出液，摇匀，立即记下时间。于30℃水浴准确保温糖化1小时。迅速加入15mL 0.1mol/L氢氧化钠溶液，终止酶解反应。冷却至室温，用水定容至刻度。同时作一空白液：吸取25mL 2％可溶性淀粉溶液，置于50mL容量瓶中，先加入15mL 0.1mol/L氢氧化钠溶液，然后准确加入5mL 5％固体曲浸出液，用水定容至刻度。（3）定糖空白液测定：吸取碱性酒石酸铜甲、乙液各5mL，置于150mL三角瓶中，准确加入5mL空白液，并用滴定管预先加入适量的0.1%标准葡萄糖溶液，使滴定时消耗的0.1%标准葡萄糖溶液在1mL以内，摇匀。于电炉上加热至沸腾，立即用0.1%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作需在1min内完成。糖化液测定：准确吸取5mL糖化液代替5mL空白液，其余操作同上。4 实验现象和数据记录表1 定糖消耗的标准葡萄糖体积空白液糖化液滴定现象蓝→无色蓝→无色标准葡萄糖溶液消耗体积ml9.26.7（稀释了10倍）（其中在做定糖的糖化液预实验时发现用标准葡萄糖溶液滴定糖化液时，没有滴加标准葡萄糖溶液时，糖化液在煮沸时由蓝色变为无色，所以我们小组把糖化液稀释了10倍后再做糖化液的定糖实验）5 计算与结果固体曲糖化酶活力定义：1g绝干固体曲，在30℃、pH4.6、1小时内水解可溶性淀粉为葡萄糖的毫克数。 即 所以，实验测得的糖化酶的活力为341.2mg。式中：V0——5mL空白液消耗0.1%标准葡萄糖溶液的体积（mL） V——5mL糖化液消耗0.1%标准葡萄糖溶液的体积（mL）C——标准葡萄糖溶液浓度（g/mL）50/5——5mL糖化液换算成50mL糖化液中的糖量（g）100/5——5mL浸出液换算成100mL浸出液中的糖量（g）W——绝干曲称取量（5.0g）1000——g换算成mg6 分析与讨论 该实验结果存在着误差，误差的原因：①我们小组的空白液和糖化液都只是做一次实验，而没有做平行实验，改进方法是各做3次平行实验；②因为我们的空白液滴定是用原液，而糖化液是用10倍稀释的，所以也会是结果不那么精确，改进放法：应把空白液也作10被稀释比较好。蛋白酶活性的测定（福林酚法）1 原理蛋白酶在一定的温度pH条件下，水解酪蛋白底物，产生含酚基的氨基酸在碱性条件下，将福林还原，生成钼蓝和钨蓝，在680nm处测吸光度。2 仪器与试剂2.1 仪器紫外分光光度计 恒温水浴锅 2.2 试剂TCA 酪蛋白溶液 碳酸钠溶液 福林试剂3 实验步骤比色管A(空白）：加酶液1ml于大试管中于40oC水浴2min，再加TCA2ml于40oC水浴10min，加酪蛋白溶液1ml，摇匀，静置10min，过滤取滤液1m