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实验五?? 小麦萌发前后淀粉酶活力的比较 一、实验目的 1．学习测定淀粉酶活力的方法。 2．了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。 二、实验原理 休眠种子中主要含有β-淀粉酶，而α-淀粉酶是在萌发过程中形成的。种子萌发时，淀粉酶活性随萌发时间迅速增加，将淀粉分解成小分子糖类，供幼苗生长。 β-淀粉酶水解非还原端的第二个α-1,4-糖苷键，水解产物为麦芽糖。 淀粉的水解产物麦芽糖有还原性能与3，5-二硝基水杨酸试剂反应，使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸。 在一定范围内，其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比，可用麦芽糖（或葡萄糖）浓度表示，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。 ?? 三、试剂 1.? 0.1％标准麦芽糖溶液 20毫升：精确称量100毫克麦芽糖，用少量水溶解后，移入100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度。 2．pH 6.9，0.02摩尔／L磷酸缓冲液 100毫升 3．1％淀粉溶液100毫升：1克可溶性淀粉溶于100毫升 0.02摩尔／L磷酸缓冲液，其中含有 0.006摩尔／L氯化钠。 4．1％3,5-二硝基水杨酸试剂: 1g 3,5-二硝基水杨酸溶于20毫升2摩尔／L的氢氧化钠溶液和50毫升水中；再加人30克酒石酸钾钠，定容至100毫升。若溶液混浊，可过滤。 5．1％氯化钠溶液300毫升 6．海砂5克 四、操作步骤 1．种子发芽： 小麦种子浸泡2.5 h后，放人25℃恒温箱内或在室温下发芽。 2． 酶液提取： 取发芽第三天或第四天的幼苗15株，放人乳钵内，加适量石英砂，加 1％氯化钠溶液10毫升，用力磨碎。在室温下放置 20分钟，搅拌几次。将提取液离心（1500转／min）6－7分钟。将上清液倒人量筒，测定酶提取液的总体积。进行酶活力测定时，将酶提取液用Ph6.9的磷酸缓冲液稀释10倍。 取干燥种子15粒作为对照（提取步骤同上）。 3．酶活力测定： ?（1）取25毫升刻度试管4支。编号。按下表要求加人各试剂（各试剂须25℃预热10分钟）。 将各管混匀，放在25℃，水浴中保温3分钟后，立即向各管中加人1％ 3，5-二硝基水杨酸溶液2毫升。（？） （2）取出各试管，放人沸水浴中加热5分钟。冷至室温，加水稀释至25毫升。将各管充分混匀。 （3）用空白管作对照；在500nm处测定各管的光吸收值，记录结果。 4．计 算 本实验规定：25℃时3min内水解淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶量为1个酶活力单位（U）。 根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，即：A标准／A未知＝C标准／C未知 C（酶液管浓度）＝A酶×C标准／A标准 则15粒种子或幼苗的总活力单位= C酶×N酶×V酶 N为酶液的稀释倍数 V为提取酶液的总体积 * * 0.5 ---- ---- ---- 蒸馏水 1 1 1 1 淀粉溶液 ---- 0.5 ---- ---- 标准麦芽糖溶液 ---- ---- 0.5 0.5 酶液 4（空白管） 3（标准管） 2（湿种子） 1（干种子） *